论文部分内容阅读
研究背景：RUNX1，也叫做AML1（acute myeloid leukemia1），位于人第21号染色体，是AML突变中最常累及的基因。t(8;21)转位是最常见的RUNX1相关的染色体转位，t（8;21）转位后，RUNX1基因的前半部分和几乎整个ETO基因融合，其表达的AML1/ETO融合蛋白具有重要的病理生理活性。研究发现，21三体综合征（T21）患儿发生白血病的风险是正常小孩的10-20倍，动物实验也证实，当RUNX1/ETO转位合并其他白血病基因突变（如，C-kit、HIP1-PDFβR）时，小鼠能被迅速诱导出白血病。越来越多的证据表明，RUNX1/ETO融合蛋白是使患者向白血病恶性转化的重要促进因素。尽管RUNX1在白血病的发生和发展中起着如此重要的作用，然而，我们对RUNX1/ETO转位的发生以及RUNX1/ETO融合蛋白表达的调控机制依然不甚了解。因此对t(8;21)转位发生机制的研究，有可能为AML治疗提供新的思路。作者在研究染色体转位时发现发现一条由RUNX1上游启动子转录，并与RUNX1基因重叠的全新长链非编码RNA（RUNX1overlapping long non-codingRNA，以下简称为RUNXOR），初步研究发现，该LncRNA能同时结合RUNX1的启动子和基因调节序列，并和RUNX1转位相关基因的染色体易断裂区特异性结合，提示该LncRNA具有重要的基因调节功能，并可能介导RUNX1染色体转位的发生。研究目的：本研究拟从长链非编码RNA RUNXOR的结构入手，以初步明确其在染色体上的位置、基因长度、转录方向及启动子序列等；在此基础上采用染色体构象分析、逆转录相关捕获及染色质免疫共沉淀等方法，对RUNXOR的功能片段进行初步筛查；对RUNXOR功能片段与DNA序列及蛋白质因子的相互及结合情况进行研究，初步探讨其在基因转录调节及染色体转位中的功能及作用机制，为白血病的病因学研究、临床治疗及预后判断提供新的理论依据。研究方法：①应用逆转录-聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）对RUNXOR的全长进行初步定位；②采用链特异性逆转录-聚合酶链反应（strand specific reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR，SSRT-PCR）确定其转录方向；③使用萤光素酶-绿色荧光蛋白报告基因检测法测定其启动子活性；④应用定量聚合酶链反应（quantitative reverse transcription PCR，RT-qPCR）法比较分析RUNXOR在正常骨髓和急性髓系白血病患者骨髓中的差异性表达；⑤使用染色体构象捕获法（chromosome conformation capture，3C）研究RUNXOR介导的染色体内环状结构的形成（intra-chromosome looping）；⑥采用逆转录相关捕获法（Reverse transcription associated trap assay）研究RUNXOR与DNA之间的结合关系；⑦RNA免疫共沉淀法（RNA immunoprecipitation，RIP）分析及染色质免疫共沉淀法（chromatin immunoprecipitation，ChIP）研究RUNXOR与调节蛋白因子之间的结合关系。研究结果：①RUNXOR启动子位于RUNX1启动子上游3.8kb左右，该LncRNA全长约216kb，其部分序列与RUNX1基因重叠，转录方向和RUNX1一致，并主要定位于细胞核内；②RUNXOR在急性髓系白血病患者骨髓中的表达量高于正常骨髓样本（P<0.05）；③阿糖胞苷（cytosine arabinoside，Ara-C）处理后白血病细胞株后，其RUNXOR表达升高（P<0.05）；④RUNXOR通过其3’端RNA序列结合RUNX1启动子及增强子结合；⑤RUNXOR通过其RNA序列与RUNX1蛋白和H3K27甲基化酶EZH2结合；⑥RUNXOR通过其3’端RNA序列结合3号染色体的EVI1、8号染色体的ETO及21号染色体RUNX1的染色体易断裂区（转位高发区）研究结论：①本研究发现了一条由RUNX1上游启动子转录，并与RUNX1基因重叠的全新长链非编码RNA(RUNX1overlapping long non-coding RNA， RUNXOR)，其转录方向和RUNX1一致，跨度超过216kb，该LncRNA主要位于细胞核内，提示其主要功能为基因转录及调控；②RUNXOR在白血病细胞株及白血病患者骨髓中高表达，考虑该LncRNA和白血病的恶性转化有关；③RUNXOR结合RUNX1启动子并可能通过募集H3K27甲基化酶EZH2等组蛋白调节因子对RUNX1基因进行表观遗传学调控；④RUNXOR通过其3’端序列与RUNX1的近端、远端启动子及增强子结合，并参与RUNX1染色体内环状结构（Intra chromosome looping）的形成；⑤RUNXOR通过其3’端RNA序列结合3号染色体的EVI1、8号染色体的ETO和21号染色体的RUNX1基因易断裂区，可能通过改变染色体空间构象，参与染色体转位的发生。创新点：本课题所研究的RUNXOR是一条新发现的长链非编码RNA，初步研究结果提示：RUNXOR通过其3’端序列结合RUNX1的近端、远端启动子及调节序列，并可能通过介导染色体内环状结构的形成及募集染色质调节因子等方式，表观遗传调控RUNX1的表达；RUNXOR能同时连接3个和RUNX1转位相关的基因的染色体易断裂区，并可能通过染色体支架功能，桥接原本空间结构不相邻的基因，为染色体转位的发生提供先决条件，此假说的提出在国际上尚未见报道。