器官移植排斥反应是一种复杂的病理生理过程,伴有大量基因的表达变化,并且各个基因之间相互影响,形成一个复杂的基因调控网络系统,特别是那些与移植排斥密切相关的低表达基因及其意义难以探测和研究。迄今为止,同种移植排斥的分子机理尚未被完全阐明,器官移植排斥反应目前为止仍是威胁患者和移植物长期存活的主要原因。近年来随着新型免疫抑制剂的不断涌现,一般情况下的临床急性移植排斥反应都得到有效控制。但是长期应用抗排斥药物,除高昂的费用外,所产生多种毒副作用,包括药物非特异性免疫抑制所致感染、肿瘤及药物的肝、肾及神经毒性是目前临床面临的严重问题。因此,深入研究并阐明移植排斥反应的分子机理,寻找特异性强,毒副作用小,效果更好的抗移植排斥药物,是移植免疫学领域迫切需要解决的问题。既往研究显示,T淋巴细胞和巨噬细胞在同种移植排斥中发挥关键作用。其中CD4+T细胞,无论是直接识别途径还是间接识别途径,与CD8+T细胞相比在介导同种移植排斥方面都显得更为重要。实验证明,在无其它种类的淋巴细胞存在的条件下,CD4+T细胞单独就足以引起同种移植排斥；外周缺失CD4+T细胞可使移植皮片存活时间明显延长。因此CD4+T细胞已经成为研究同种移植排斥的关键靶细胞,CD4+T细胞的移植排斥相关基因的表达状况受到高度关注。基因在组织器官中的差异表达是机体分化、发育、衰老等生命现象的分子基础,基因的差异表达特征为其功能研究提供了重要信息。应用RT-PCR及微阵列法对肾、肝、心脏、角膜及皮肤移植模型的研究证明,上述移植模型都存在基因表达的显著差异。以往研究报道,在同种移植排斥中,CD4+T细胞有多种基因异常表达,尽管研究表明这些基因与移植排斥密切相关,但是利用相关基因敲除小鼠或用特异性单克隆抗体阻断相关基因通路,对已知的移植相关免疫活化基因进行敲除或阻断,并不能完全阻断移植排斥,甚至某些条件下对移植物的生存无显著影响。研究结果提示,在同种移植排斥过程中除了已知的高拷贝表达基因外,可能还有一些低拷贝表达基因发挥重要作用。而以往的研究手段难以发现这些基因。主要原因一是目前常用的基因表达分析方法敏感度较低,不能发现低拷贝差异表达基因；二是大多数研究采用移植物组织或外周血细胞等多种细胞在内的复合组织为样本,由于多种细胞基因型及其表达谱的差异,目标细胞的基因表达情况被其他细胞亚群的数据干扰,许多有用的信息被淹没在背景信息之中。因此目前急需要构建一种能够限定目标细胞纯度,排除其他细胞及手术、创伤、感染等因素对目标细胞基因表达情况干扰的模型,并应用更敏感的基因表达检测手段进行分析,从而更好地筛选CD4+T细胞差异表达的移植排斥密切相关低拷贝基因,阐明CD4+T细胞介导移植排斥的确切机制。基因表达序列分析(Serial Analysis of Gene Expression, SAGE)是一种能够快速、详细、准确地反映生物体在不同的发育期及生理、病理状态下基因表达水平的有效工具,它不需已知基因序列,对低丰度转录本敏感,可发现新基因。凭借这些独特优势,SAGE现已广泛应用到生命科学的各个领域,为了解正常作用机制、肿瘤发病机制、信号分子调控机制提供了有效工具,但其在移植领域的应用尚处于起步阶段。应用SAGE技术寻找同种移植排斥相关低拷贝基因,并进行功能确定、封闭或敲除,对于深入研究移植排斥反应分子机理,发现早期特异性预测指标,研制特异性抗排斥药物都有着深远的影响。本课题第一部分利用SCID小鼠作为同种皮肤移植受体,采用CD4+T细胞过继性转输诱导同种移植排斥,有效排除手术、创伤、感染等因素的影响,避免CD4+T细胞的基因表达情况被其他类型T细胞亚群和B细胞的干扰,使背景更加清晰,并应用更敏感的SAGE技术建立基因表达文库,准确全面的反映同种移植排斥中CD4+T细胞基因表达情况,通过对差异表达基因进行功能分析,在基因组水平全面了解同种移植免疫排斥反应的基因表达的特点,为进一步探讨CD4+T细胞介导的同种移植排斥反应机理奠定坚实的实验和理论基础。氧化应激是指机体内高活性分子如活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)和活性氮簇(reactive nitrogen species, RNS)产生过多或消除减少,从而导致组织损伤。研究证明氧化应激是引起多种移植物损伤的主要因素,近来研究发现抗氧化治疗能够减轻环孢霉素A(CsA)引起的器官毒性。因此寻找一种既能有效诱导移植耐受又能对抗氧化应激的免疫抑制剂,具有重要的临床应用价值。近年发现,非洲臀果木提取物(Pygeum africanum extract, PAE)具有抗炎、抗肿瘤、抑制细胞增殖、抑制细胞迁移的作用。本课题首先应用大鼠糖尿病膀胱内氧化应激模型,证明PAE可从多个指标上改善氧化应激状态。一氧化氮(Nitric oxide, NO)是活性氮簇之一,在免疫系统中发挥重要的生理病理作用。NO可作为一种重要的效应分子参与移植排斥。以往研究显示,人、小鼠、大鼠器官或组织移植后,血浆NO及组织NOS水平与移植排斥反应的严重程度呈正相关。特异性抑制NO生成,可以有效延长移植物存活时间。应用免疫抑制剂如CsA有效诱导移植耐受后,血浆NO水平也明显降低。研究证明,NO生成受多因素调节,巨噬细胞生成NO完全依赖于活化的CD4+T细胞,应用抗Thy1.2或抗CD4+T细胞的抗体能明显抑制浸润巨噬细胞产生NO,而用抗CD8+T细胞抗体后,NO生成无明显变化。CD4+T细胞依赖的NO生成可能与Th1／Th2平衡有关,Thl型细胞因子如IFN-γ,TNF-α促进诱生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)的表达,而Th2型细胞因子则通过上调精氨酸活化,抑制L-Arg的生物利用度,抑制NO生成和巨噬细胞活化。近年来干扰素调节因子家族(Interferon Regulatory Factors, IRFs)在机体免疫应答中的作用受到高度关注。IRF-1是γ-干扰素下游基因的转录激活因子,可以活化iNOS、IL-12、P40表达及Thl、CD8+T、NK细胞的免疫应答,在移植免疫领域受到高度关注。最初研究显示,IRF-2可作为拮抗剂与IRF-1竞争同一转录位点。但近来研究发现,IRF-2也是组蛋白H4、Bcl2、FasL的转录激活因子,IRF-2还与其他转录因子协同活化基因转录,例如与Statl形成复合物,参与细胞因子依赖的TAP1转录活化；与IRF-1协同活化CHTA和GBP1。此外,IRF-1和IRF-2基因缺失小鼠在Th1细胞分化缺陷,NK细胞发育异常和细胞因子分泌方面都有很大相似性,Bernd Elser等人研究结果显示IFN-γ通过IRF-1和IRF-2在转录水平上抑制IL-4表达,提示IRF-1和IRF-2是IFN-γ对抗Th2型免疫应答的重要调节因子。IRF-2在同种移植排斥中的作用尚未有报道。本研究建立的SAGE文库中,多个参与调节体内氧化应激水平的IFN-γ信号转导通路成员差异表达,同种移植排斥组干扰素调节因子-2明显升高(Interferon regulatory factor 2, IRF-2,同种移植排斥组：对照组=8：3,p=0.041),因此我们推测机体接受同种抗原刺激后,CD4+T细胞上调IRF-2表达,调节CD4+T向Th1漂移,进而活化巨噬细胞生成NO,NO作为效应分子参与同种移植排斥。因此本课题第二部分在进一步验证IRF-2在同种移植排斥中的作用后,研究非洲臀果木提取物(Pygeum africanum extract, PAE)抗同种移植排斥反应的作用及机理。第一部分同种排斥CD4+T细胞差异表达基因的筛选目的：应用CD4+T细胞过继转输-SCID小鼠的同种皮肤移植排斥模型,限定同种移植排斥中CD4+T细胞纯度,排除其他细胞亚群及手术、创伤、感染等因素对目标细胞基因表达情况干扰,并应用更敏感SAGE技术,准确全面的反映同种移植排斥中CD4+T细胞基因表达情况,为阐明CD4+T移植排斥反应机理奠定理论基础。材料和方法：建立CD4+T细胞过继输入-SCID小鼠同种皮肤移植排斥组和对照组模型。同种移植组发生完全排斥时取脾,制备脾细胞悬液,用CD4+T细胞纯化柱纯化CD4+T细胞,流式细胞术鉴定细胞CD4+表型,确定细胞纯度。提取CD4+T细胞总RNA,构建SAGE文库,筛选鉴定出小鼠同种移植排斥相关低拷贝基因,并应用EASE软件对差异表达基因进行功能分析。结果：1.以SCID小鼠为移植受者,B6小鼠或BABL／c小鼠为移植皮片供者,3周后皮片愈合良好。此时过继输入野生型BABL／c小鼠纯化CD4+T细胞,14天后B6-SCID小鼠移植皮片发生排斥,而BABL／c-SCID小鼠移植皮片无排斥发生,表明成功建立了CD4+T细胞介导的小鼠同种移植排斥模型和同系对照组模型。通过对同种排斥高峰期脾CD4+T细胞基因表达SAGE文库确定的185个差异表达基因进行功能分析,发现68个基因具有已知生物学功能,包括37个在同种移植组高表达的基因和31个在同种移植组低表达的基因。主要涉及抗原递呈、细胞增殖、细胞分化、细胞周期、细胞凋亡、细胞活化、防御反应、磷酸化、转录调节、细胞生长与维持、信号传导等功能,研究结果为从基因组水平深入研究移植排斥机理、寻找同种排斥关键基因,从根本上治疗和预防移植排斥奠定了实验基础。2.功能分析显示,多个参与调节体内氧化应激水平的IFN-γ信号转导通路相关基因显著性差异表达,如Statl(10：1,p=0.003)、Jak2(1：5,p=0.047)、Irf2(8：3,p=0.041),提示氧化应激在同种移植排斥中具有重要意义。结论及意义：1.成功建立CD4+T细胞过继输入-SCID小鼠同种皮肤移植排斥模型和对照组模型,排除其他细胞亚群及手术、创伤、感染等因素对CD4+T细胞表达情况干扰,更准确的反映同种移植排斥中CD4+T细胞基因表达情况。2.SAGE文库确定的185个排斥高峰期脾CD4+T细胞差异表达基因与多种生物学功能密切相关,主要涉及细胞凋亡、转录调节、细胞生长及维持、信号转导和氧化应激调节等。3.参与IFN-γ信号转导通路的氧化应激相关基因在同种移植排斥中发挥重要的作用。第二部分PAE抗移植排斥作用的研究目的：氧化应激是引起多种移植物损伤的主要因素,抗氧化治疗可以减轻环孢霉素A等免疫抑制剂引起的肾脏毒性,延长移植物存活时间。本课题第一部分研究发现,同种移植排斥中,多个参与调节体内氧化应激水平的IFN-γ信号转导通路相关基因差异表达,提示氧化应激在同种排斥过程中具有重要意义。非洲臀果木提取物(PAE)具有抗炎、抗肿瘤、抑制细胞增殖、抑制细胞迁移的作用,推测该药物对同种移植排斥具有潜在的应用价值。但是该药物在移植免疫学领域的应用尚未见报道。本课题首次体内研究PAE对小鼠同种皮肤移植排斥的影响,并进一步探讨该药物对氧化应激模型和同种皮肤移植排斥过程中氧化应激相关基因IFN-γ、IRF-2、iNOS表达及活性的调节,旨在进一步探讨氧化应激相关基因在同种排斥中的作用及PAE的抗移植排斥机理。材料和方法：1.PAE对同种移植皮片存活状况的研究：建立脾细胞过继输入-SCID小鼠同种皮肤移植排斥模型和对照组模型,从建立模型第2天开始,药物组每天分别腹腔注射PAE 12.5 mg／kg、25 mg／kg、50 mg／kg、100 mg／kg,对照组给予相应剂量佐剂。逐日观察并记录移植物存活状态。2.PAE对氧化应激的作用：Wistar大鼠经股静脉注射STZ方法构建糖尿病膀胱组织氧化应激模型,对照组大鼠注射相应剂量佐剂。成功建立模型4周后,药物组大鼠每天灌胃给予PAE 100 mg／kg,对照组给予相应剂量佐剂,药物应用4周后,各组分别检测PAE对氧化应激组织的iNOS表达,CAT和SOD活性的影响。3.PAE抗移植排斥机理的研究：建立脾细胞过继转输-SCID小鼠同种皮肤移植排斥模型和对照组模型,药物组分别给予不同浓度PAE,对照组给予相应剂量佐剂,移植第14天时(此时对照组完全排斥),应用一氧化氮合成酶试剂盒,检测各组小鼠血清中总NOS活性；免疫组化检测移植皮片及脾脏iNOS表达状况；RT-PCR检测移植受者脾脏组织IRF-2、IFN-γmRNA表达情况；放射免疫分析法检测各组小鼠血清中TNF-α水平。在同种移植对照组排斥高峰期处死各组小鼠,取脾,制备脾细胞悬液,体外培养24h,收集上清。在LPS刺激的腹腔巨噬细胞培养中,加入上述不同组脾细胞培养上清,24h后检测培养上清中总NOS活性。结果：1.给小鼠同种皮肤移植模型体内应用PAE,25mg／kg／day,连续14天,可明显延长移植皮片的存活时间,改善移植物生存状况(p<0.05)。2.体内应用PAE,可明显降低氧化应激模型膀胱组织中iNOS蛋白表达,升高CAT及SOD活性(p<0.05)3.与对照组相比,25mg／kg PAE处理同种移植模型小鼠14天后,血清中总NOS活性,移植皮片及脾脏组织中iNOS蛋白表达明显受到抑制；脾脏IFN-γ和IRF-2 mRNA表达显著下调,模型小鼠血清中TNF-α水平明显降低(p<0.05)体外实验表明,25mg／kg PAE处理组第14天的小鼠脾细胞培养上清能够明显抑制巨噬细胞总NOS活性(p<0.05)。结论：25mg／kg／day PAE可以有效延长同种移植皮片存活时间；PAE抗排斥机理与其抗氧化应激作用有关,可下调同种移植排斥中氧化应激相关基因IFN-γ和IRF-2的表达,下调受体及移植物局部NOS表达及活性,抑制巨噬细胞分泌NOS和TNFα,有效改善移植物存活状态。研究结果为进一步阐明CD4+T细胞依赖的巨噬细胞分泌NO的机理奠定了基础,也为PAE应用于抗移植排斥提供了重要的实验依据。结论和意义1.本课题成功建立了CD4+T细胞过继转输-SCID小鼠同种皮肤移植排斥模型和对照组模型,排除其他细胞亚群及手术、创伤、感染等因素对CD4+T细胞基因表达情况干扰,更准确地反映同种移植排斥中CD4+T细胞基因表达情况。该模型构建的SAGE文库筛选出185个排斥高峰期脾CD4+T细胞差异表达基因,发现其具有多项生物学功能,最主要参与细胞凋亡,转录调节,细胞生长和维持,信号转导通路、氧化应激调节。研究结果为深入研究移植排斥反应分子机理,研制特异性抗排斥药物,从根本上治疗或预防移植排斥反应奠定了坚实的理论基础。2.对差异表达基因进行功能分类表明,多个参与IFN-γ信号转导通路的氧化应激相关基因差异表达,表明该通路在同种移植排斥中发挥重要作用。3.首次探讨了PAE体内应用对同种移植排斥反应的调节及机理,研究结果表明该药物可以明显延长移植物存活时间,其作用机理与通过降低氧化应激相关基因和蛋白,调控Th1／Th2相关细胞因子表达,抑制巨噬细胞生成NO有关。研究结果为进一步阐明CD4+T细胞依赖的巨噬细胞分泌NO的机理奠定了基础,也为PAE应用于抗移植排斥提供了重要的实验依据。创新点1.首次应用CD4+T细胞过继转输-SCID小鼠同种排斥模型建立SAGE文库；在基因组水平对同种移植排斥中CD4+T细胞进行差异基因表达筛选,筛选出185个排斥相关低拷贝基因。2.筛选出的多数基因在移植领域迄今尚未见报道,表明SAGE是高灵敏、高通量基因转录组研究工具。筛选结果及功能分类研究丰富了同种排斥中CD4+T细胞基因表达信息资源,为今后确定同种移植排斥的关键基因提供了坚实基础,具有重要意义。3.首次探讨了PAE对同种移植排斥反应的作用及机理,研究结果表明该药物可通过调节机体氧化应激水平抗移植排斥,为PAE应用于抗移植排斥提供了重要的实验依据。