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研究目的:
随着手机通讯使用在全球范围的广泛增加,射频电磁场(RadiofrequencyElectromagnetic Fields,RF—EMFs)的生物学效应引起了人们的关注。大脑是RF-EMFs的敏感部位,人们对其影响的研究报道多种多样,说明研究RF-EMFs的生物学效应的必要性。本文建立神经损伤的体外细胞模型,寻求RF-EMFs促进细胞增殖的最佳物理参数,并初步探讨RF-EMFs对神经细胞的功能调节与毒理作用。
研究方法:
本研究利用葡萄糖(D—Glucose,D—Glu)和过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)诱导未分化PC12细胞,制成神经损伤的ex vivo细胞模型。应用改良噻唑蓝[3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di—phenytetrazoliumromide,MTT]比色法研究细胞增殖、细胞活性；采用二辛可宁酸(bicinchoninic acid,BCA)法测定细胞蛋白总量；采用圆二色谱仪测定培养基及培养液中各大分子成分二级结构的影响；通过酶循环反应法测定胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸辅酶(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)和其还原形式NADH的比值NAD+/NADH(本文简称NAD+水平)。
研究结果:
1.手机微波辐射对葡萄糖处理的PC12细胞增殖变化的影响
(1)葡萄糖作用的时间-效应、剂量—效应关系:PC12细胞以不同糖浓度[5、25、50、75和100 mM]分别处理12、24、36、48、72和96 h,12-96 h的任一检测时间点,PC12细胞生长的曲线大致呈钟形。以25 mM D-Glu浓度细胞增殖最快,细胞数量最多。与25 mM相比,5和100 mM处理48 h均可明显抑制细胞生长(P<0.05)。随时间延长,抑制更为明显。
(2)三种糖浓度[5 mM(Low Glucose Condition,LG)、25 mM(Normal GlucoseControl,NG)、100 mM(High Glucose Condition,HG)]处理的PC12,按手机微波辐射不同时间[0、5、15、30和60 min]分为Ctr1、MP5、MP15、MP30和MP60,与Ctr1组相比,MP5、MP15、MP30和MP60组对NG处理的PC12细胞增殖无影响(P>0.05)。但可逆转LG、HG处理的PC12细胞增殖受抑。与Ctr1组相比,MP5、MP15、MP30和MP60组,LG细胞活力由84.84％分别上升至95.67％、109.11％、109.79％和106.29％,差异具有非常显著性(P<0.01)；HG细胞活力由79.3％分别增加为103.3％、94.89％、101.37％和99.3％,差异具有统计学意义(P<0.01)。尤以MP30组效果最为显著。
(3)PC12细胞生长在NG条件中,不同种植密度[0.75、1、1.5、2、2.5和3×104/cm2],MP30对各种植密度细胞活力无影响(P>0.05)。以2×104/cm2的密度种植为佳(P=0.915)。
(4)PC12细胞以不同糖浓度[LG、NG和HG]分别培养12、24、36、48和72 h,MP30对NG处理的PC12细胞活力无影响(P>0.05),可使LG和HG处理的PC12细胞活力上升。与Ctr1组相比,MP30对LG处理的PC12细胞生长第一、第二天,细胞增殖加速,差异有显著性(P<0.05)；对HG处理的细胞生长第一至三天,明显促进细胞增殖,差异具有非常显著性(P<0.01)。
(5)三种糖浓度[LG、NG和HG]培养PC12细胞,手机辐射30 min作用不同次数[单次辐射组(换液后即刻手机辐射,M1)、隔日辐射组(在换液后即刻和48 h各辐射一次,M2)、每日辐射组(在换液后即刻与24、48 h分别辐射一次,M3)]。与Ctr1组相比,LG处理的PC12细胞,M1、M2细胞活力上升(P<0.05),M3不影响细胞活力的改变(P>0.05)。HG处理组中,仅M1可上调细胞活性(P<0.05),M2、M3辐射组无影响(P>0.05)。对NG组中,M1、M2、M3对细胞活力均无影响(P>0.05)。
(6)圆二色谱仪检测不同糖浓度的新鲜培养基[LGM(Low Glucose Medium,5 mM低糖培养基)、NGM(Normal Glucose Medium,25 mM常糖培养基)、HGM(High GlucoseMedium,100mM高糖培养基)]以及用于培养PC12细胞的培养上清[LGS(Low GlucoseSupernatant,低糖培养上清)、NGS(Normal Glucose Supernatant,常糖培养上清)、HGS(High Glucose Supcmatant,高糖培养上清)]。LGM、NGM、HGM组间比较,培养基中各大分子成分的二级结构无差异(P>0.05)。培养上清间进行比较,与NGS组相比,LGS、HGS均存在显著性差异(P<0.01)。MP30分别处理以上培养基及培养上清,与Ctr1组相比,差异均无显著性(P>0.05)。
(7)NG培养的PC12细胞,暴露于MP30预辐射处理后换新鲜不同糖浓度[LG、NG和HG]培养基孵育48 h,与Ctr1组相比,NG处理的PC12细胞不受影响,可使LG、HG处理的细胞活力明显增加(P<0.05)。MP30辐射处理不同糖浓度[LG、NG和HG]培养基后,用于培养PC12细胞,与Ctr1组相比,对细胞活力无影响(P>0.05)。
(8)检测0-24 h内不同糖浓度[EG、NG和HG]培养的PC12细胞胞内NAD+水平,其变化呈现一定规律性。糖浓度[LG、NG和HG]处理30 min后即刻收样(0 h)时间点最高,2 h最低,6、12、24 h有所回升,但均低于即刻组。MP30辐射处理,变化规律相同。与Ctr1组相比,0和24 h时,上调LG处理的PC12细胞NAD+水平(P<0.05),下调HG处理的细胞NAD+水平(P<0.05),0 h NG处理的细胞NAD+水平(P<0.05)下降,但24 h变化不显著(P>0.05),且LG、HG处理的细胞NAD+水平均高于NG处理组(P<0.05)。
2.手机微波辐射对H2O2诱导的PC12细胞氧化损伤的调节作用
(1)H2O2对NG培养的PC12细胞活力呈浓度和时间依赖性。不同浓度H2O2[0、100、150、200和300μM]处理PC12细胞24、48 h,100μM处理24 h不引起细胞损伤,但较高浓度150μM处理24 h可使细胞活力下降为68.2％(P<0.01)。且随着孵育时间的延长,损伤进一步加剧。
(2)PC12细胞[NG+0μM H2O2、NG+150μM H2O2],诱导细胞24 h,辐射分组为Ctr1、MP5、MP15、MP30、MP60组,与Ctr1组相比,MP5、MP15、MP30组细胞活力明显升高(P<0.01),MP15与MP30间无差异(P>0.05),对蛋白总量亦无影响(P>0.05)。MP60则明显降低细胞活力,并引起蛋白总量的降低(P<0.01)。
(3)圆二色谱仪检测含与不含H2O2的新鲜培养基[NGM、HM(Contain150μM H2O2of Normal Glucose Medium,含150μM H2O2培养基)]以及用于培养PC12细胞的培养上清[NGS、HS(Contain150μM H2O2 of Normal Glucose Supernatant,含150μM H2O2培养上清)],与NGM相比,HM培养基中各大分子成分的二级结构无差异(P>0.05)。与NGS相比,HS亦无差异(P>0.05)。MP30分别处理以上培养基及培养上清,与Ctr1组相比,差异均无显著性(P>0.05)。
(4)NG培养的PC12细胞,暴露于MP30预辐射处理后换新鲜培养基[NGM、HM]孵育24 h,与Ctr1组相比,NGM处理的PC12细胞不受影响,可使HM处理的细胞活力明显增加(P<0.05)。MP30辐射处理培养基[NGM、HM]后,用于培养PC12细胞,与Ctr1组相比,对细胞活力无影响(P>0.05)。
(5)检测0-24 h内[NG、HM]培养的PC12细胞胞内NAD+水平,其变化呈现一定规律性。培养基[NG、HM]处理30 min后即刻收样(0 h)时间点最高,2 h最低,6、12、24 h有所回升,但均低于即刻组。0 h时间点,NG与HM相比无差异(P>0.05),24 h时,HM明显上调NAD+水平(P<0.01)。MP30辐射处理,变化规律相同。与Ctr1组相比,0 h时使NAD+水平升高,24 h下降(P<0.01),但仍高于NG处理组(P<0.01)。
研究结论:
1、低浓度(5 mM)和高浓度(100 mM)葡萄糖均抑制细胞增殖,呈时间和浓度依赖性。高糖抑制较低糖更为显著。25 mM D-Glu使细胞进入增殖内稳态(proliferation-specific homeostasis,PSH)。
2、手机微波辐射对处于PSH及不同种植密度的PC12细胞没有调节作用。MP5、MP15、MP30、MP60均不引起PC12细胞活性、细胞生长发生改变。手机微波辐射促进远离PSH的功能恢复PSH。高糖诱导的PC12细胞增殖受抑、活性下降,可被MP5、MP15、MP30、MP60逆转,恢复PSH。低糖引起细胞增殖受抑、活性降低,MP5、MP15、MP30可明显升高细胞活力。
3、手机微波辐射对H2O2诱导的PC12细胞氧化损伤的调节,低剂量促进内稳态的建立,高剂量则具有毒理作用。MP5、MP15、MP30细胞活力明显升高,但不影响细胞的蛋白总量。且MP15与MP30间无差异。与高低糖实验作用结果有类似之处,MP30效果较为佳。不同的是,辐射暴露时间延长至60 min,则出现相反的效应,细胞活力明显降低,并引起蛋白总量的降低,起着毒理作用。
4、手机微波辐射对细胞的生物调节作用,直接作用于细胞本身,引起细胞增殖和活性效应的改变,而非通过培养环境起作用。且预辐射处理30 min,可提高PC12细胞活性,以对抗高低糖对PC12细胞增殖的抑制作用和H2O2诱导的氧化损伤。
5、PC12细胞胞内NAD+水平0-24 h呈动态规律性变化,0 h最高,2 h最低,6、12、24 h有所回升,但仍低于即刻组。手机辐射30 min可引起胞内NAD+水平发生变化,24 h时,对正常糖浓度没有辐射影响,对低糖组可升高NAD+水平,对高糖及H2O2辐射组则降低NAD+水平。这一效应可能通过NAD+依赖的组蛋白去乙酰化酶1起作用,具体机制有待进一步研究验证。