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恶性肿瘤是严重威胁人类生命健康的疾病之一。随着医学研究的进步，人们在外科手术的基础上发展出化学治疗、放射治疗、免疫治疗等手段。虽然各种治疗方法都有一定的效果，但是都很难达到预期的目的，肿瘤转移仍然是临床治疗中最常见的无法解决的问题，往往就意味着治疗的失败。目前甚至没有很好的早期诊断肿瘤转移的方法。为了解决这个问题，研究者把重点集中在肿瘤转移的分子机制方面，试图通过研究参与肿瘤转移过程的各种分子，了解其中的相互关系，从而发展出更为有效的诊断和治疗手段。 骨肉瘤是骨科临床最常见的原发恶性骨肿瘤，恶性程度高，治疗困难，其早期转移是造成患者死亡的主要原因。对骨肉瘤发生和发展相关基因的研究，有助于提高对肿瘤转移机制的认识，促进诊断和治疗研究的深入。我们联合运用基因芯片技术和反义寡核苷酸技术研究具有不同转移能力的两种骨肉瘤细胞基因表达谱，筛选差异表达基因，探索筛选研究骨肉瘤转移相关基因的新途径。 常规培养本室建立的人骨肉瘤细胞系SOSP-9607、高转移亚系SOSP-M。用Gibco公司的Trizol试剂一步法加以改进抽提培养的SOSP-9607及SOSP-M总RNA。 从提取的RNA逆转录合成cDNA第一链。在cDNA第一链合成中掺入荧光标记dUTP，用Cy3-dUTP标记SOSP-9607 cDNA，用Cy5-dUTP标记SOSP-M cDNA。探针乙醇沉淀后溶解在5×SSC+0.2％SDS杂交液中。 基因芯片和杂交探针分别置于95℃水浴中变性5min，立即将探针加在基因芯片上，盖玻片封片，置于密封舱内60℃杂交15～17h。揭开盖玻片，分别用2×SSC+0.2％SDS，0.1％×SSC+0.2％SDS，0.1％×SSC洗涤10min，室温晾干。 用ScanArray 3000扫描仪扫描芯片，提取基因表达的荧光信号强度值。 第四军医大学博士学位论文用内参照基因对 Cy3和＊ 的原始提取信号进行均衡和修正。用 ImaGene 3刀软件分析Cy3和＊ 两种荧光信号的强度和比值。原始数据作标准化处理，算出所有基固的RatiO值（CyslCy3）。筛选出RatiO大于2或小于0．5的数据项共 101项，再从此数据中找出具有同一 Gene ID号的成对差异基固，共门组22个数据项。这些数据所代表基固与两种探针杂交时表现出一定差异，上下调趋势一致，程度相近。说明骨肉瘤发生转移的过程中，相当数量的基因表达水平发生了不同程度的变化，部分基固参与细胞生长和分化、细胞周期调节、信号转导等过程。 在基因芯片筛选的基础上，我们设计了相应的反义寡核旮酸进行体外试验，探索基因表达水平改变与细胞生长特性之间的关系。当BRCAI和BLCAP的 ASODNs剂量为 10 p moMi时均可促进人骨肉瘤 SOSP9607细胞生长，自第M起，对细胞生长速度产生明显的影响（P＜0刀5）。 与对照组集落形成数（51土5）比较，BRCAI－ASODNS组的集落形成数（85上8）显著增加（P＜0刀1）；＊＊＊＊卜＊SO＊NS组的集落形成数（90士7）显著增加（P＜0刀1）。＊＊＊AI－＊SO＊Ns组与＊＊＊＊P．＊SO＊Ns组间无显著性差另IJ（P＞0．05）。 细胞周期检测结果，BRCAI－ASODNS组、BLCAP－ASODNS组与对照组相比，PI指数、S期上调，细胞增殖活性均增强。两种基因的 ASODNS对于细胞增殖活性有相似的促进作用。 SABC 法染色结果表明，BRCAI 蛋白定位于骨肉瘤细胞浆中；BRCAI－ASODNS作用后人骨肉瘤细胞SOSP－9607的BRCAI蛋白表达水平明显降低，染色由强阳性转为弱阳性。 BLCAP基因（又称为be10基固）是国外学者在研究侵袭性膀肤癌时发现的，编码一个分子量为10KD的蛋白，功能尚不清楚。初步研究表明其与细胞侵袭性相关，考虑可能是一种新的抑癌基固。我们在研究骨肉瘤转移相 4 第四军医大学博士学位论文关基因时发现，BLCAP基因在人骨肉瘤细胞内也有表达，并且在高转移亚系中表达水平明显降低。本研究克隆BLCAP基因，并重组原核、真核细胞表达质粒，为进一步研究BLCAP基固功能创造条件。 根据BLCAP基因序列设计特异性PCR引物，扩增BLCAP基因ORF（BLCAP基因 CDNA中的 255－508hp之间的 263hp 片段），在上、下游引物分别力。N EC。RI、h。I酶切位点。 抽提培养的SOSP习607总RNA。以总RNA为模板，OligOUT厂 为引物，在鼠莫洛尼白血病病毒（MMLV）反转录酶催化下合成第一链。以反转录产物作模板，PCR扩增目的片段。PCR产物大，J。约280hp，用低溶点琼脂糖凝胶电泳回收，Wizardm Minicolumn纯化。 将纯化回收的 PCR产物与 pGEM1 easy A体连接，连接产物命名为pGEMELCAP。转化JM109感受态细菌，随机挑取5个白色菌落扩大培养，提取质粒，EC。RI、XhOI双酶切鉴定。选择酶切鉴定阳性克隆，测序。pGEM－BLCAP质粒DNA序列坝定结果与已发表的BLCAP基因CDNA中的255－508hp之间的序列相同，证明BLCAP基固克隆成功。 逆转录病毒载体pCDNA3＊及重组pGEM－BLCAP均用设计酶切位点作ECORI、XhOI双酶切，?