糖类物质HPCE柱前衍生新方法的研究

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快速、有效的糖类物质分析方法,一直以来便是推动糖生物学发展的重要组成部分,但由于糖类物质缺乏紫外或荧光吸收,需对样品进行柱前衍生使其带有紫外或荧光基团,从而可通过紫外或荧光检测器对其进行检测。纵观已有的衍生剂和分析方法,具有衍生反应条件苛刻、衍生反应后处理复杂、酮糖衍生效率低下、分析条件复杂等缺点。本研究拟寻找一种新型衍生剂和分析手段,简化包含酮糖在内的多种单糖、二糖分析过程并提高酮糖检测灵敏度。本文采用了一种新型分析方法——对甲氧基苯胺(4-Methoxyanline)柱前衍生毛细管电泳法,对衍生反应条件进行优化,对方法进行了考察,并将此方法应用于不同生物样品的分析,取得了很好的效果。本研究主要取得以下研究成果和结论:  1、首次将对甲氧基苯胺柱前衍生方法应用于检测多种单糖、二糖混合物,利用HPCE和DAD对分离结果进行分析和检测。对衍生反应条件进行了优化,确定了衍生反应时间、温度、pH、还原剂、衍生试剂加入量等因素,考察了方法的稳定性、灵敏度、检测限等。结果表明:衍生化反应条件温和(80℃、120 mins),衍生产物无需进行萃取等复杂处理过程便可络合后进样分析,衍生产物稳定性好,60 hrs内RSD<4%。  2、随后实验确定了柱前衍生对甲氧基苯胺毛细管电泳分离11种单糖、二糖的分析方法:采用pH10.21350 mmol/L的硼酸水溶液作为电解液,在分离电压25 kV、柱温25℃的条件下,使用紫外检测器234 nm分析检测了包含葡萄糖、果糖、麦芽糖、木糖、核糖、鼠李糖、来苏糖、甘露糖、乳糖、半乳糖、纤维二糖在内的8种单糖、3种二糖的混合物,方法日内精密度<6%,最低检测限可达100 nmol/L,相关系数在0.9991~0.9999之间,可作为定性定量的分析方法。  3、实验将本方法应用于藏红花植物多糖细胞成分的定量分析。优化藏红花多糖水解过程,确定了藏红花植物细胞多糖的成分组成为:核糖0.113 g/g,葡萄糖0.807 g/g,果糖0.00043g/g,半乳糖0.018 g/g。  4、最后,实验通过简化毛细管电泳分离条件确定了两种发酵液中糖类成分跟踪检测的方法。其中用于丁二酸发酵中糖类跟踪检测的方法为:pH9.150mmol/L四硼酸钠水溶液加入10%甲醇,分离电压28 kV,柱温25℃;漆酶发酵跟踪检测方法为:pH9.140 mmol/L四硼酸钠,分离电压30 kV,柱温25℃。两种方法快速、可靠、稳定,为发酵过程中糖类成分消耗的跟踪检测提供了良好的检测手段。
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