论文部分内容阅读
碱性蛋白酶（alkaline proteases,AprEs）可以水解肽键,生成氨基酸或肽类物质,具有良好的耐热、耐碱能力,因而广泛地应用于洗涤、制革、纺织、医药、食品等领域。AprEs应用前景广阔,然而目前对AprEs的研究仍然集中在洗涤剂添加剂方面。因此,挖掘新型AprEs并进一步拓宽其应用范围具有重要的意义。论文从筛选高活性的AprE生产菌株出发,通过分析其基因组,从中挖掘新型的AprE基因对其进行克隆表达,并研究重组酶的酶学性质及其在手性药物拆分和牛奶蛋白质脱敏中的应用,具有一定的意义和价值。论文的主要研究成果如下:（1）对实验室保藏的芽孢杆菌进行平板初筛,得到4株具有明显AprE生产能力的菌株;经过发酵培养和酶活测定,得到一株高活性AprE生产菌株W3,酶活高达69.88U·mL-1,先前已被鉴定和命名为高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis W3）。（2）利用B.altitudinis W3全基因组信息,筛选得到51条蛋白酶基因,其中有9条被初步确定为AprE基因,分别命名为baapr1-9。对这9条AprE基因进行生物信息学分析与克隆表达验证,共得到4个有活性的AprEs:BaApr1、BaApr2、BaApr5和BaApr9;在以偶氮酪蛋白为底物时,BaApr1的酶活最高,达到180.58 U·m L-1。测定4个重组菌株的发酵生长曲线与酶活曲线,发现与空载对照菌株相比,4个重组菌株的生长均受到一定程度的抑制,尤其是B.subtilis WB600-pMA0911（wapA）-baapr1（Bp1）,表明AprEs影响了重组菌的生长。进行多序列比对,显示4个AprEs均属于S8A亚家族。（3）以偶氮酪蛋白为底物研究BaApr1、BaApr2、BaApr5和BaApr9的酶学性质,显示它们的最适pH分别为9.5、8.5、10.5和10.5,最适温度分别为55、50、60和45℃,在中温和碱性条件下均表现出较好的稳定性与耐受性。4个AprEs被Ca2+和Mg2+激活,并且被乙二胺四乙酸（EDTA）和苯甲基磺酰氟（PMSF）抑制,属于典型的丝氨酸蛋白酶;对表面活性剂具有较好的耐受性;除了正己烷外,大部分有机溶剂表现出一定程度的抑制作用。4个AprEs均对酪蛋白（或以酪蛋白为主要蛋白质成分的底物）表现出较高的酶活,具有较高的特异性;BaApr2和BaApr5表现出对明胶的水解活性,而BaApr1和BaApr9未表现出水解活性。分别以偶氮酪蛋白、酪蛋白和脱脂奶粉为底物研究动力学参数,对BaApr1,Km值分别为1.16、2.39和5.09 mg·mL-1,kcat/Km值分别为15926.07、16739.36和7582.19 s-1·(mg·mL-1)-1;对BaApr2,Km值分别为1.07、1.82和7.74 mg·mL-1,kcat/Km值分别为2091.65、2995.06和584.93 s-1·(mg·mL-1)-1;对BaApr5,Km值分别为0.24、0.19和0.29 mg·mL-1,kcat/Km值分别为5532.74、28067.23和12207.45 s-1·(mg·mL-1)-1;对BaApr9,Km值分别为1.95、1.31和5.75 mg·mL-1,kcat/Km值分别为1367.09、10953.37和1697.99 s-1·(mg·mL-1)-1。（4）BaApr1在手性药物拆分中的效果不明显。BaApr1对牛奶蛋白质表现出良好的水解效果,可以有效地水解三种牛奶中的蛋白质,释放出游离氨基酸或小分子多肽,游离氨基酸中亮氨酸含量最高,分别为38.20、89.41和85.02μg·mL-1,这表明BaApr1在牛奶蛋白质脱敏中具有广阔的应用前景。