随着发病率和病死率的不断增高,肺癌已成为全世界范围内因肿瘤导致死亡的首要原因。早期缺乏有效的诊断方法和晚期缺乏有效的治疗手段是预后较差的主要原因。国内外肿瘤研究学者从不同角度探讨了肺癌的发生及进展机制,发现肺癌细胞与正常组织细胞的不同之处主要在于细胞增殖能力增强、细胞凋亡发生降低、基因突变率上升、化疗药和靶向药物等耐受增加等,并发现这些肿瘤征象与癌细胞受某些非编码RNA调节过程的失控相关;非编码RNA是指不编码蛋白质的RNA,一般包括lncRNA,microRNA,rRNA,tRNA,snRNA等多种RNA;它们具有相似的特点就是从基因组转录之后不翻译成蛋白质,可以在RNA水平发挥各自的生物学功能和作用。近几年来非编码RNA在转录环节调控肺癌发生发展方面受到了越来越多的关注。文献报道在microRNA与肿瘤的研究中,miR-21与肺癌的密切关系和调控已经研究的比较丰富和成熟;miRNA-21在转录后发挥作用,通过下游靶基因调控肺癌,主要涉及有PDCD4（程序性细胞死亡4）基因,PTEN（磷酸酯酶-张力蛋白同源物）基因和NFIB（核因子I/B基因）等。而lncRNA长度一般大于200个碱基,主要以RNA的形式在表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等三个层面的发挥作用,其异常的表达既可以作为抑癌基因又可以作为致癌基因,参与了包括多种肿瘤的发生发展过程。很多研究报道lncRNA与肺癌关系密切,在促进肺癌侵袭转移,促进非小细胞肺癌细胞生长和集落的形成,促进肺癌发生发展,调控致癌基因的激活,增强肺癌细胞的稳定性,造成化疗耐药等方面可能起着关键的调控作用。我们应用进口lncRNA芯片和生物信息学技术（TCGA数据库和Pubmed）进行了比对验证,筛选出了lncRNA-H19。然而,肺癌细胞内调控分子众多（原癌基因,抑癌基因等）,信号通路调控错综复杂（PI3K/AKT,Wnt信号等）,调控网络纵横交错,单一的非编码RNA调控可能并不能起到关键作用,几种非编码RNA协同调控可能才是调控肺癌发生发展的驱动因素,但是调控的具体机制却并不清楚。因此,本实验主要是针对H19和miR-21在非小细胞肺癌中的表达以及与非小细胞肺癌的生物学特性和预后的相关性研究,继而通过体内体外实验进一步明确H19在非小细胞肺癌中对miR-21及其下游靶基因的具体的分子调控机制,希望对于肺癌的早期诊断,揭示预后,能够有所帮助,同时为肺癌的治疗提供新的靶点。第一部分:LncRNA H19和miR-21与非小细胞肺癌的生物学特性以及预后的相关性研究目的:研究LncRNA H19与miR-21在非小细胞肺癌中的表达高低以及与非小细胞肺癌生物学特性、临床病理资料和预后的相关性。材料和方法:200例非小细胞肺癌组织和正常肺组织标本来源于在我科住院手术病人。用实时定量PCR的方法(相对定量,2^-△△Ct法)测定两组中H19的表达和miR-21的表达。将两者的表达高低与肺癌的生物学特性进行联系和分析;根据随访数据,明确H19、miR-21与非小细胞肺癌的预后关系。结果:H19和miR-21在肺癌组织中的表达都要高于正常组,且肿瘤大于3厘米、出现远处转移标本中,H19和miR-21表达升高;T分期越高、N分期越高、TNM分期越高,H19和miR-21表达越高。H19和miR-21在肺癌中的高表达与肺癌的预后呈负相关,表达越高,生存率越低。结论:H19和miR-21可为肺癌的诊断提供帮助;H19和miR-21的高表达与肺癌的预后呈负相关;H19的表达高低可能跟肺癌的进展有关,miR-21的表达高低可能跟肺癌的早期诊断关系更密切;H19和miR-21可以成为肺癌的预后指标。第二部分:LncRNA H19对非小细胞肺癌细胞增殖以及miR-21表达变化的调控机制研究（体外实验）目的:体外实验研究H19表达变化对非小细胞肺癌细胞增殖的影响以及miR-21表达变化的影响。材料和方法:体外培养A549和H1299肺癌细胞株,给予质粒转染过表达H19,siRNA-H19转染抑制H19表达,然后用MTT法,流式细胞技术检测肺癌细胞的增殖情况变化;根据H19的过表达/抑制表达,检测miR-21的表达变化。结果:H19过表达,肺癌细胞增殖活跃;H19表达受抑制,肺癌细胞生长受抑制明显;H19过表达,miR-21表达增高,H19抑制表达,miR-21表达降低。结论:体外实验中,H19可以调控肺癌细胞的增殖:H19过表达,肺癌细胞增殖活跃,H19抑制表达,肺癌细胞增殖受抑;H19的表达与miR-21表达呈正相关,可能存在调控关系。第三部分:LncRNA H19对miR-21及其下游靶基因表达变化的调控机制研究（体内实验部分）目的:体内实验研究H19基因沉默对非小细胞肺癌动物模型中肿瘤大小、重量的影响,对miR-21及其下游靶基因的表达的影响。材料和方法:体外培养A549细胞注入裸鼠左侧背部;随机分组,每组6只,分为空白对照组（Control）、H19基因沉默组（shH19）、miR-21封闭组（antagomiR-21）、H19基因沉默组+培美曲噻+顺铂干预组（shH19+pemetrexed+cisplatin）、H19基因沉默组+易瑞沙干预（shH19+Gefitinib）、培美曲塞+顺铂组（pemetrexed+cisplatin）、易瑞沙干预组（Gefitinib）,比较各组肿瘤大小、重量变化,然后予以切片染色,定量PCR和Western Blot鉴定目的基因的表达,检测H19,miR-21及其下游靶基因的表达水平。结果:所有实验组均较对照组肿瘤生长缓慢,其中H19基因沉默+吉非替尼组肿瘤生长最缓慢。H19基因沉默+吉非替尼组对肿瘤抑制作用最明显;H19基因沉默的相关组与对照组相比,肿瘤体积及重量明显缩小和减轻。Q-PCR和Western-blot实验提示H19基因沉默后miR-21表达明显降低,miR-21下游靶基因PTEN（phosphate and tension homology deleted on chromsome ten）、PDCD4（Programmed cell death protein 4）明显增高,NFIB（Nuclear factor 1 B-type）表达下降。与单纯化疗和靶向药物相比,联合H19基因沉默,与对照组相比差别更加明显。结论:H19基因沉默对肿瘤具有明显抑制作用,加吉非替尼后作用增强;miR-21表达随着H19表达降低而降低,两者呈正相关表达,H19沉默,可以引起miR-21下游靶基因中PTEN和PDCD4表达明显升高,NFIB表达下降;H19基因沉默可以增强化疗药物和靶向药物的作用;H19可能在肺癌中对miR-21及其下游靶基因起到调控作用。H19可能成为肺癌治疗新靶点。