卤醇脱卤酶可以通过分子内亲核取代机制来催化邻卤醇和环氧化物之间的相互转化,而且它的催化反应是非常高效高选择性的。正因为具有这些特点,使得卤醇脱卤酶可以广泛应用在手性药物及精细化工合成领域中,用来合成具有光学纯的高价值化学中间体。然而,由于工业生产条件的苛刻,卤醇脱卤酶对极端条件尤其是高温不具有耐受性,使其在工业生产中不能够很好的发挥其催化性能。为此,我们采用蛋白质工程手段来提高卤醇脱卤酶的热稳定性。由于蛋白质的热稳定性往往受多种因素影响,很难采用理性设计的方法来实现,因此本文采用定向进化方法对卤醇脱卤酶的热稳定性进行改造研究。本研究中,结合已有卤醇脱卤酶的酶活力筛选方法的筛选效率,我们首先采用大引物易错PCR的方法构建了一个低突变频率(2-3 a.a.mutation/gene)文库。在筛选了2000多个克隆后,我们最终得到了6个突变体包含8个突变位点,且这些突变体在55℃下处理100 min后的残余活性比野生型提高15倍左右。为了进一步提高突变体的热稳定性,我们采用迭代定点饱和突变(ISM)策略对得到的位点进行叠加。通过筛选2200个突变体后,我们得到了一系列热稳定性更高的突变体,其中最好的突变体Var4在65℃条件下t1/2比野生型提高3400倍,并且在75℃下放置30 min后仍然保留75%的残余活性。稳态动力学和动力学拆分实验结果显示,两个最好的突变体Var3和Var4并没有因为突变位点的引入而影响了其活性,而且对二氯一苯基乙醇的对映体选择性并未有较大的影响。相关结构分析结果表明,突变体热稳定性的提高可能是由于突变后新引入的一些分子间相互作用力使得突变位点所在的loop更加稳定,以及新增加的疏水相互作用使得蛋白质的三级结构更加稳定。通过本课题的研究,证明采用与ISM策略相结合的低突变频率的定向进化方法在蛋白质的热稳定性改造过程中是非常高效的,这也许可以成为蛋白质工程领域改造酶热稳定性的一种比较好的方法。另外,相关研究结果也可以为进一步阐明卤醇脱卤酶HheC的结构和功能之间的关系提供帮助。