细胞内的生物分子对其遗传、代谢等各种生命活动具有重要影响,如线粒体DNA(mtDNA)和G四联体DNA(G4 DNA)等生物大分子可参与生命体系中基因的表达与调控、蛋白质翻译等生命活动。生物小分子如三磷酸腺苷(ATP)不仅可以作为细胞活性指示剂,而且其代谢异常与多种人类疾病相关。因此,对细胞内生物分子的特异性检测至关重要。荧光探针检测法由于具有灵敏度高、特异性强、响应迅速等特点,成为用于分子识别和光学成像的有效工具,然而对细胞内核酸类及ATP等生物分子的特异性高效识别和检测仍是生物学研究的薄弱领域。本论文设计、合成了三例荧光探针分子,通过性能测试及细胞成像应用研究,分别实现了对mtDNA、G4 DNA和ATP的高效特异性识别和荧光成像,具体工作如下:(1)设计并合成了一例用于活细胞中线粒体DNA(mtDNA)特异性成像的双光子荧光探针CNQ。光谱性能测试表明CNQ具有较大的Stokes位移(140 nm),与mtDNA响应时间为10 s,荧光强度增加182倍,结合常数为2.8×105 M-1,双光子吸收截面为98.4 GM,检出限低至55.1 μg/L。圆二色谱、粘度、熔融温度实验及分子对接计算表明CNQ与mtDNA之间为小沟槽模式结合。探针分子与不同细胞器的复染实验表明CNQ为线粒体定位,与双链DNA试剂PicoGreen的复染实验表明CNQ结合了细胞质中的双链DNA,即mtDNA。Hessian-SIM超分辨细胞成像实验进一步从微观角度证明了 CNQ对活细胞中mtDNA的特异性识别与成像,双光子共聚焦荧光成像实验实现了对阿霉素诱导的mtDNA损伤时线粒体形态学变化的实时追踪与成像。(2)设计并合成了一例G四联体DNA(G4 DNA)特异性识别与成像的双光子荧光探针CZ-BT。光谱实验表明,不同粘度环境下的探针分子均以单分子状态存在,不发生聚集。该探针可以对Tris-HCl缓冲溶液中的G4 DNA进行特异性识别,检出限低至15.6 nM,且几乎不受其它单、双链DNA的干扰。与G4 DNA结合后探针分子的寿命由1.43 ns增加至2.98 ns。圆二色谱实验及分子对接计算表明,CZ-BT与G4 DNA之间的作用方式为π-π堆积。双光子激发波长为820 nm,可以有效地避免生物背景荧光的干扰。探针分子和商业化G4 DNA药物PDS的竞争性双光子共聚焦成像实验和细胞周期实验充分证明了 CZ-BT对细胞内G4DNA的特异性。(3)设计并合成了一例线粒体ATP特异性的长沙荧光探针Rh-ATP。探针分子在HEPES缓冲溶液中呈闭合状态几乎无荧光,ATP存在时,探针分子内二乙烯基三胺上的氢原子和ATP磷酸基团上的氧原子之间形成氢键,导致罗丹明开环发出荧光。Rh-ATP对ATP具有良好的选择性,结合比为1:1,几乎不受其它常见阴阳离子的干扰,荧光量子产率增加20倍。较长的发射波长(740 nm)可有效避免细胞内生物背景的干扰,MCF-7和COS7细胞内细胞器复染实验中Rh-ATP和线粒体的复染系数分别高达0.90和0.89。细胞内ATP含量变化实验中,探针分子的荧光强度和细胞内外加ATP的浓度成正比。用无糖培养基对细胞孵育8 h后可抑制细胞的生长活性,抗癌药物顺铂的加入会诱导细胞凋亡,这两种方式均会导致细胞内产生ATP的量降低,实验表明细胞内探针分子Rh-ATP的荧光强度也随之下降。以上细胞实验均实现了对细胞内ATP含量变化的实时快速检测及成像。