猪流行性腹泻(Porcine Epidemic Diarrhea,PED)是由猪感染了猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus PEDV)引起的一种急性、高度接触性传染病。感染PEDV病毒后以消化器官损伤最为严重,主要临床症状为呕吐、水样腹泻和脱水等。鉴于在过去的30年里,PEDV在亚洲国家的广泛流行己经引起了世界各国的关注,并积极采取各种措施来防治该病,但直到近几年来仍在世界范围内持续不断地广泛传播,并在受感染的猪场反复感染发病,一年内爆发多次。能够针对PEDV病原具有高敏感性高特异性的抗体对病原的检测还是猪只治疗都具有显著效果。传统的鼠源单抗,由于大批量的单抗生产费用高、耗时长,并且这种大分子进入体内不稳定、渗透性差等缺点一一展现,限制了其应用。而在骆驼体内发现的单域抗体因其所具备的良好的作为诊断工具的潜力实验诊断向的特性成为基因工程抗体中的研究热点。本研究旨在针对PEDV病原,使用新型的噬菌体展示技术T7 Select系统建立丰度较高的驼源单域抗体库并从中筛选出高性能抗体亚型,并以合适的表达系统对其表达与鉴定。研究主要内容如下(1)使用PEDV灭活疫苗免疫双峰驼,在六免后采取外周血,并使用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。对获得的淋巴细胞提取RNA,并反转成c DNA,使用巢式PCR的方法以c DNA为模板扩增出编码单域抗体的基因序列。对获得的编码序列建立质粒文库并鉴定,并从鉴定后的质粒文库中切下目的片段连接T7基因组的载体臂T7Select10-3B。对获得完整基因组进行体外包装获得展示目的片段的噬菌体库。对噬菌体库进行亲和性生物淘选,以双抗夹心包被的方式提高筛选的效率。并在特异性富集的四级库里筛选表现阳性的单克隆基因型,以Phage-ELISA的方法确定高特异性抗体基因型。(2)对所获得的三个阳性亚型的基因进行克隆,克隆片段连接p ET-30a载体,构建PVT表达载体。转化BL21(DE3)菌株进行表达。对于获得的重组抗体进行WB验证,并且用ELISA的方法评价抗体效价与交叉反应率。对重组抗体进行间接免疫荧光(IFA)分析与免疫细胞化学分析(ICC)以评价抗体的胞内活性。所得阳性亚克隆基因型表现出较高的亲和性与特异性。