大豆疫霉(Phytophthora sojae)侵染大豆(Glycine max)引起大豆疫霉根腐病是大豆生产上的毁灭性病害之一。大豆疫霉和大豆之间的互作符合“基因对基因”假说,大豆疫霉分泌的无毒效应分子与寄主植物抗病基因产物之间的相互作用直接决定着大豆疫霉根腐病的发生,在分子水平上研究大豆疫霉无毒效应分子和大豆抗性基因互作机理是解释病害发生机制根本途径,并为病害的防治提供重要的理论基础。本研究以生物信息学分析为基础,以RXLR结构域、转录以及不同小种中序列的多态性等特征迅速筛选到一批候选无毒效应分子,结合大豆疫霉菌遗传学和分子生物学研究手段,从其中鉴定到了无毒效应分子Avrld。同时建立起卵菌中无毒效应分子克隆的新方法,对卵菌中无毒效应分子的克隆具有指导作用,对其他病原菌无毒效应分子的研究也具有重要的借鉴意义。多态性研究表明,效应分子Avr3b和Avrld可以通过氨基酸的大规模突变或缺失来逃避所抗病基因产物的识别,揭示了大豆疫霉毒性变异机制。对Avrld毒性机制进行研究发现,Avrld能够和E3泛素连接酶发生互作,该基因在植物免疫系统中具有重要的作用；从而初步揭示了效应分子调控寄主免疫反应的新机制。主要的研究结论如下：大豆疫霉无毒效应分子Avrld的鉴定。对目前已经鉴定的卵菌无毒效应分子进行分析表明,该类基因具有RXLR结构域、侵染阶段表达以及在毒性和无毒菌株中表现出多态性的特征,以此特征为基础筛选出Avrld的候选基因并设计CAPS标记。通过在Avrld的毒性菌株和无毒菌株为亲本进行杂交产生F2群体中进行遗传学标记分析,结果表明Avh6基因型在F2后代群体中与Avrld的表型共分离。基因枪瞬时表达结果表明Avh6能够被Rpsld识别,同时发现C端是识别的关键区域。Avrld在菌丝、孢子囊、休止孢萌发以及侵染早期表达量较高,说在大豆疫霉侵染大豆过程中发挥重要的作用。本章研究通过生物信息学和遗传学相结合的方法鉴定大豆疫霉无毒效应分子Avrld,对卵菌中其他无毒基因的克隆乃至其他病原菌的克隆具有重要的借鉴意义。无毒效应分子Avrld的多态性及功能分析。采用下胚轴创伤接种法对24株不同来源大豆疫霉菌株在含有Rpsld的大豆鉴别寄主进行毒力表型测定；其中12株表现为毒性,12株表现为无毒。通过设计Avrld的特异性引物对24株大豆疫霉进行扩增,结果表明在毒性菌株中Avrld是缺失的,无毒菌株中可以扩增出目的大小片段。对扩增出的片段测序后发现2种序列AvrldP6497和AvrldP7064,并且两者之间存在较多的氨基酸差异。将2种序列在Rpsld大豆叶片上进行瞬时表达均能引起细胞坏死,说明都能够被Rpsld识别。对Avrld进行选择压力分析发现105位的赖氨酸(K)是承受选择压力最大的位点。无毒菌株中的2种序列均能够抑制BAX引起的细胞坏死以及抑制Avrlb和Rpslb之间互作引起的ETI,在烟草中过表达后均能够促进辣椒疫霉的侵染。Avrld融合GFP后对其定位进行观察,在细胞质和细胞核中都能观察到荧光。融合核定位信号和核输出信号后改变了Avrld的定位,仍然能够被Rpsld所识别,但是失去了促进辣椒疫霉侵染烟草的功能。本章研究对Avrld毒性变异、毒力功能以及定位进行详细分析,揭示了Avrld逃避抗病寄主识别的机制;功能与定位研究为进一步揭示其毒性机理提供重要的研究基础。无毒效应分子Avrld毒性机理研究。大豆疫霉在侵染大豆过程中会分泌大量的效应分子到寄主细胞的不同部位来破坏或调控寄主植物的防卫反应,从而创造一个有利于自身侵入和繁殖的环境。筛选并研究效应分子的作用靶标对揭示大豆疫霉的致病机理具有重要作用。为了研究Avrld的毒性机制,通过酵母双杂交的方法筛选与大豆互作的蛋白。筛选结果表明,Avrld与大豆Gm06860蛋白能够互作。通过酵母双杂交方法对基因全长和载体互换以及GST Pull Down进行互作的进一步验证,表明2个蛋白能够发生互作。对Gm06860序列分析发现,该蛋白具有E3泛素连接酶结构域,对其连接酶的活性进行测定后表明其具有酶活性。而泛素连接酶中关键氨基酸的突变C263A和W290A使其丧失了酶活性,同时W290A的突变也影响了与Avrld的互作,说明该位点是与Avrld互作的关键位点。本章对Avrld的致病机理研究发现,Avrld能够和E3泛素连接酶发生互作,从而影响寄主的防卫反应;从而揭示了效应分子调控寄主免疫反应的新机制。无毒效应分子Avr3b多态性及识别区域分析。对大豆疫霉无毒基因PsAvr3b的序列多态性、转录以及识别区域进行了分析。结果表明,PsAvr3b在毒性菌株和无毒菌株中存在2种不同的多态性.与无毒序列相比,毒性序列存在很多的氨基酸突变,在72、73位存在氨基酸的缺失;并且由于核苷酸的突变导致毒性序列在231位的氨基酸位点提前终止,使其缺少了约100个氨基酸。正向选择分析表明76A和92S位点承受到植物抗病基因的选择压力最大。序列分析表明PsAvr3b具有Nudix motif,具有ADP核糖/NADH焦磷酸化酶活性。转录结果表明Avr3b在无毒和毒性菌株中均有表达,在无毒菌株中表达量较高。PsAvr3b的C端是被Rps3b识别的关键区域,酶活性关键位点的突变对识别没有影响。以上研究表明Avr3b通过大量的氨基酸突变以及提前终止来逃避抗病基因的识别,揭示了其毒性变异的机制。