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研究目的：血管性痴呆(vascular dementia, VD)主要表现为智力相关功能的进行性不可逆的衰退或消失,作为一种年龄相关性疾病除与脑血管病相关外,也与神经细胞的异常死亡及中枢神经系统的衰老有着密切的联系。血管紧张素Ⅱ(Angiotensin II, Ang II)是肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system, RAS)的核心部分,最新研究表明脑内RAS存在可影响正常的神经可塑性和学习记忆等认知功能,参与脑老化过程。衰老是正常机体组织细胞结构和功能的进行性衰退过程,与痴呆的进行性不可逆性变化相吻合,据此我们推测也许是Ang Ⅱ通过诱导神经细胞衰老继而诱导或促进VD的发生。因此,本研究课题利用体外培养的PC12细胞和大鼠原代海马神经元,研究Ang Ⅱ致神经细胞衰老的作用,并利用特异性受体阻断剂探讨其相关机制。研究方法：1.体外培养PC12细胞,MTT法检测不同浓度Ang Ⅱ诱导以及最佳Ang Ⅱ诱导浓度下分别加入厄贝沙坦、PD123319、卡托普利处理后PC12细胞生长增殖情况；SA-β-gal染色后观察细胞衰老染色形态变化；ELISA法检测端粒酶逆转录酶(Telomerase reverse transcriptase, TERT)活性；Western blot检测TERT、P53、P21在衰老PC12细胞中的表达变化。2.选用新生24h内的乳大鼠体外培养原代海马神经元,并观察不同生长时间下细胞形态变化。采用不同诱导浓度Ang Ⅱ和时间处理细胞,通过SA-β-gal染色检测神经细胞衰老情况,确定Ang Ⅱ诱导细胞衰老的最佳浓度和时间；进一步检测厄贝沙坦和PD123319对Ang Ⅱ诱导神经细胞衰老的影响；Western blot法检测P53、P21的表达变化。研究结果：1. Ang Ⅱ (1-1000μmol/L,48h)呈浓度依赖性地抑制PC12细胞增殖,10μmol/L Ang Ⅱ孵育48h可有效诱导细胞衰老,厄贝沙坦、PD123319、卡托普利对PC12细胞无毒性作用,而厄贝沙坦和卡托普利可不同程度的改善AngⅡ对细胞的抑制作用并减缓细胞衰老,而PD123319无此作用；ELISA检测到AngⅡ处理组TERT活性明显降低,Western blot证实TERT表达减少,P53、P21表达增加,厄贝沙坦和卡托普利组可不同程度地增加TERT活性和表达,降低P53和P21表达,而PD123319对此无影响。2.在原代海马神经细胞实验中,10μmol/L Ang Ⅱ孵育48h可诱导神经细胞衰老；Western blot检测到Ang Ⅱ组P53、P21表达增加,厄贝沙坦可抑制AngⅡ所致神经细胞衰老,降低P53、P21表达量,而PD123319对此无作用。研究结论：10μmol/L AngⅡ孵育48h可诱导PC12细胞和大鼠原代海马神经细胞衰老,此过程由ATI受体介导,与AT2受体无关。AngⅡ诱导神经细胞衰老的机制可能与TERT表达及活性降低,P53、P21表达增加有关。研究目的：衰老自由基学说认为机体组织细胞产生的自由基不断积累损伤蛋白质、核酸进而引起结构和功能的退行性变化,最终导致机体或细胞衰老发生。活性氧(reactive oxygen species, ROS)基团是指含氧的自由基,可产生氧化应激引起生物大分子的氧化损伤继而影响细胞衰老进程。过氧化氢(hydrogen peroxide, H2O2)能产生大量自由基,常被用作细胞氧化应激诱导剂。目前研究发现H202可诱导血管内皮细胞衰老进而引发血管衰老,但H202诱导神经细胞衰老的作用及机制少见报道。灯盏乙素(scutellarin)是中药灯盏花的主要有效成分,被广泛用于治疗心脑血管疾病。近年来研究发现,灯盏乙素具有抗氧化能力,可减轻细胞内ROS累积,减轻氧化损伤而保护细胞。因此,本研究利用体外培养的PC12细胞研究H202诱导神经细胞衰老的作用及机制,并进一步探讨灯盏乙素的保护作用。研究方法：利用SA-β-gal染色观察在不同诱导浓度和不同诱导时间下H2O2致PC12细胞衰老情况,确定最佳诱导浓度和诱导时间；进而采用SA-β-gal染色检测不同浓度灯盏乙素对H2O2诱导PC12细胞衰老作用的影响；Real-time RT-PCR法测定TERT、P53、P27和P21mRNA的表达情况；ELISA法检测端粒酶逆转录酶(TERT)活性变化；Western blot法检测TERT以及细胞周期调控相关蛋白P53、P27和P21的蛋白表达情况。研究结果：10μmol/L H2O2组处理细胞24h即可见细胞固缩呈圆形,48h核固缩加剧、细胞破裂、坏死,随着处理时间增加几乎看不到残存正常细胞,视野全呈碎片状；1μmol/L H2O2处理48h可有效诱导PC12细胞发生衰老,细胞肿胀呈“笑脸状”,β-gal阳性(蓝色)细胞明显增多；不同灯盏乙素可不同程度地减轻细胞衰老,其中10μmol/L灯盏乙素P-gal阳性(蓝色)细胞减少最为明显(P＜0.01)；H202处理组TERT活性明显降低(P＜0.05),TERT表达明显下降(P＜0.05),P53、P27和P21表达均明显增加(P＜0.05,P＜0.05,P＜0.05)；与H2O2组相比,灯盏乙素可使TERT活性和表达均明显增加(P＜0.05,P＜0.05),使P53、P27和P21表达均明显降低(P＜0.05,P＜0.05,P＜0.05)。研究结论：1μmol/L H2O2孵育48h可诱导PC12细胞衰老,衰老发生机制可能与TERT活性和表达降低,P53、P27和P21表达增加有关；灯盏乙素可不同程度地减轻H2O2所致PC12细胞衰老,并提高TERT活性和表达、抑制P53、P27和P21的表达。