第一章成年大鼠海马脑片神经细胞电生理特性及MK801对痫性放电的干预目的:探讨Glu及KA喷浴对大鼠海马脑片的兴奋性损伤机制及MK801对痫性放电的干预效应。方法:⑴脑片制作:成年Wistar大鼠,7~8周龄,体重200g±10g。断头取出脑组织,按海马长轴切成厚约300μm的薄片。将全部脑片迅速置于95% O2和5% CO2混合气体饱合的ACSF的容器内,放入35~37℃的恒温水浴箱中水浴1小时,再移入24~25℃的恒温水浴箱中再水浴3~4小时待用。⑵采用膜片钳全细胞模式进行观察:①海马CA3区神经细胞的基本电生理特性、对Glu、GABA的反应;②Na+、K+、Ca2+全细胞电流测定;③Glu、KA诱导海马CA3区神经细胞痫性放电的特性及影响因素;MK801对海马脑片神经细胞痫性放电的影响。结果:1.孵育的海马脑片细胞成活率大于80%,CA3区锥体细胞个大,细胞数目多而集中。神经元细胞表面光滑,反光一致,突起明显。2.成年大鼠海马脑片神经细胞封接有一定的难度,成功率约60%～70%(n=400)。细胞静息电位为61.2±6.8mv(n=200)。根据C-slow和G-series读数,膜电容Cm和串联阻抗Rs分别为16.36±2.7pF、10.03±1.7GΩ。时间常数t(=Cm×Rs)为159.4±41.23μs(n=57)。恒流电刺激可产生多个动作电位,Glu诱导海马神经细胞出现可逆性去极化,并产生阵发性动作电位,GABA抑制电流刺激诱发的动作电位发放。3.全细胞模式下,可以记录到呈电压依赖性,快速激活并快速失活的内向Na+电流,外向K+;Ca2+电流为内向电流,激活较慢,失活也较慢,电流在40mV时开始被激活, 0mV时电流达到高峰,具有内向整流的特征,当普通细胞外液换成无钙细胞外液时,该电流消失。4.恒流电刺激、灌流Glu或KA均可见到>3Hz的自发性、阵发性或簇发性痫性放电。喷射MK801可以抑制海马神经细胞痫性放电,Glu组抑制率优于KA组。结论:1.成年大鼠海马具有有序的神经元和纤维排列,其纤维和突触部位容易定位,便于进行电生理操作;经过孵育的成年大鼠海马脑片神经细胞,具有完整的Na+、K+、Ca2+离子通道。2.恒流电刺激、Glu和KA均对海马细胞产生兴奋性,均可致海马神经细胞反复自发性痫性放电。3.MK801不仅能阻断电刺激诱发的动作电位,而且还能抑制Glu或KA诱发的痫性放电,有利于神经细胞维持正常神经功能,减少不良反应。第二章伽玛刀照射红藻酸癫痫大鼠后NMDAR表达及调控机制的实验研究目的:研究伽玛刀照射红藻酸癫痫大鼠后,NMDAR在大鼠兴奋性痫性损伤机制发生发展过程中的作用及调控机制。方法:Wistar大鼠分成以下3个组:①A组,对照组(正常大鼠);②B组,红藻酸致痫模型大鼠组;③C组,伽玛刀(40Gy,4mm)照射红藻酸致痫大鼠组。选取照射后7d、14d、21d、35d、49d共5个时间点进行观察。用电生理记录仪观察癫痫发作次数;光镜、电镜、Timm′s染色观察形态学及超微结构改变;水迷宫观察大鼠的学习记忆功能;NMDA免疫组化观察伽玛刀照射后组织形态学改变;Western blotting、RT-PCR法检测NMDA蛋白及其mRNA的表达,高效液相色谱法检测细胞内Glu浓度,Fura-2/AM单波长荧光法测细胞内游离Ca2+浓度的变化。结果:1.伽玛刀照射后大鼠发作次数有显著意义的减少(P<0.05)。2.癫痫大鼠伽玛刀照射后形态学改变以神经元的损伤为主。表现为神经元胞体浓缩变性,异染色质增加、边聚、染色质聚集。核皱缩变形,核膜不规则内陷。3.伽玛刀照射后21~49天苔藓纤维发芽明显减少(P<0.05)。4.伽玛刀照射后癫痫鼠的记忆功能改变与NMDA受体表达下降呈显著性正相关(P=0.005,r=0.816)。5.NMDA mRNA表达显著下调,与NMDA蛋白表达呈显著性正相关(P=0.004,r=0.912);与Glu浓度及细胞内游离的Ca2+浓度变化相一致。结论:伽玛刀(40Gy、4mm准直器)照射红藻酸癫痫大鼠海马可以明显减少致痫大鼠癫痫发作频率,并且对被照癫痫大鼠记忆功能无明显损伤。伽玛刀照射红藻酸癫痫大鼠可能通过直接或间接影响脑细胞内Glu的浓度,调节NMDA mRNA的表达,引起Ca2+浓度下降,Glu-NMDA-Ca2+表达下调是癫痫终止发作的基础。