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目的1.从SD新生鼠嗅黏膜取材原代培养提纯鉴定嗅鞘细胞。2.探讨嗅鞘细胞在体外模拟的脊髓损伤缺氧内环境中是否诱导自噬,并检测自噬对嗅鞘细胞增殖能力的影响。3.验证嗅鞘细胞移植对大鼠半横断损伤的治疗作用。4.探讨SPIO体外标记嗅鞘细胞的合适方案,以及体外成像特点。方法1.用酶消化法和改良的Nash差速贴壁法分离提纯嗅鞘细胞,采用CCK-8法绘制生长曲线,选出增殖较好的细胞代次;利用免疫荧光法鉴定细胞属性和纯度。2.采用氧浓度为2%作为低氧条件(低氧处理组),培养SD新生鼠嗅黏膜来源的OECs,以正常条件下培养的OECs作为对照组,采用自噬抑制剂3-MA处理后的OECs继续在低氧条件下培养作为3-MA低氧处理组,在相差显微镜下观察细胞形态;对照组、4 h低氧处理组、8 h低氧处理组,Western blotting法检测各组OECs中HIF-1α(Hypoxia inducible factor-1,低氧诱导因子-1α)、自噬标志蛋白LC3Ⅰ/Ⅱ和自噬标志基因Beclin-1的蛋白表达水平;对照组、自噬抑制剂3-MA处理的OECs然后在正常条件下培养作为3-MA处理组、低氧组、3-MA低氧处理组,采用CCK-8法检测各组OECs的增殖能力。3.建立SD大鼠脊髓左侧半横断损伤模型,实验组伤后立即注射嗅鞘细胞,对照组只注射完全培养基,单纯损伤组不注射。于1、2、4、6、8周对各组实验鼠进行大鼠后肢运动功能(BBB)评分。明确嗅鞘细胞移植对脊髓半横断损伤大鼠的治疗效果。4.用多聚左旋赖氨酸包被过的SPIO纳米粒子标记OECs,普鲁士蓝染色和透射电镜下观察标记结果,对标记后的嗅鞘细胞进行细胞活性和增殖能力的检测并实现体外MRI成像。结果1.经原代分离、提纯培养的SD新生鼠嗅黏膜来源嗅鞘细胞大多数呈梭形,典型的双极、三极细胞形态。激光共聚焦显微镜下GFAP和P75双染阳性的为嗅鞘细胞。根据计算公式其纯度可达87%。2.与对照组比较,低氧组嗅鞘细胞中HIF-1α表达水平增高(P<0.05),LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的转化明显,Beclin-1表达水平增高(P<0.05);自噬抑制组中嗅鞘细胞增殖能力降低(P<0.05)。3.实验组与对照组和单纯损伤组比较,P<0.05,具有统计学差异;对照组与单纯损伤组在各个时间点比较P>0.05,无统计学差异;随着时间的推移各组BBB评分也在升高。4.成功应用SPIO标记嗅鞘细胞且不影响其生物学特性,MRI体外成像显示1×106数量级细胞在轴位和矢状位的T2WI和SWI序列上信号可较好显示。结论1.低氧诱导的自噬对大鼠嗅鞘细胞的增殖能力具有促进作用。2.嗅鞘细胞移植对脊髓半横断损伤有治疗作用。3.成功应用SPIO标记嗅鞘细胞且不影响细胞基本生物学特性和增殖能力,并实现MRI体外成像,为以后嗅鞘细胞移植入脊髓的示踪问题奠定了基础。