近年来，随着核能、核技术的广泛使用，人们与放射线接触的机会日益增多，因辐射造成的损伤日益受到关注。辐射损伤的机制之一，是受到电离辐射后机体产生过量的自由基，导致机体内自由基的清除和产生失衡，诱发氧化应激反应，引起细胞膜、DNA、蛋白质等生物大分子损伤，使机体的细胞、组织、器官的形态和功能发生改变，造成机体损伤，甚至癌变。染料木黄酮为黄酮类化合物，广泛存在于蔬菜、水果及茶叶中，具有多种生物学活性，其抗氧化作用已得到确证。研究表明染料木黄酮也具有抗辐射作用，其抗辐射功能与其具有酚羟基结构有关。染料木黄酮抗辐射主要通过淬灭自由基，抑制脂质过氧化，提高抗氧化酶系统的活性等，从而保护细胞免受氧化损伤。血管内皮细胞对电离辐射较为敏感，是辐射后正常组织发生放射性损伤的重要靶点之一，血管内皮细胞功能紊乱在高血压、心力衰竭、动脉粥样硬化（AS）等心血管疾病的发病过程中具有重要意义。基于染料木黄酮在抗氧化方面的研究进展，本实验选用HUVEC细胞为心血管系统辐射损伤的模型细胞，从辐射诱导的自由基损伤机制入手，研究X射线单次照射所致的辐射损伤效应，探讨黄酮类化合物染料木黄酮对单次X射线辐射所致损伤的防护效果及可能的作用机制，以期为染料木黄酮在心血管系统辐射损伤方面的研究提供实验依据。具体内容如下：（一）X射线致HUVEC细胞损伤模型的建立低剂量电离辐射易产生兴奋性效应，对免疫系统具有一定的刺激性作用，能提高机体免疫能力，并能使小剂量预辐射照射后的大剂量辐射产生适应性。较大剂量则易使细胞大量致死，降低免疫力和诱发肿瘤。因此，本部分实验以人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）为实验对象，建立辐射损伤的细胞模型，观察不同时间点、不同剂量X线辐照后HUVEC细胞的存活率，以期选出合适的实验辐照剂量。X射线分别以中低剂量75mGy、100mGy、200mGy、400mGy、中高剂量1.2Gy、2.4Gy、3.6Gy、4.8Gy、6.0Gy辐照HUVEC细胞，照后分别孵育24h、48h、72h，MTT法检测各组细胞的存活率。从实验结果来看，与正常对照组比较，中低剂量组单次照射后24h细胞活力均增强，细胞存活率均>100%；照后48h，400、1200mGy组细胞活力降低（<100%，p<0.05）；照后72h，各中低剂量组细胞存活率均<100%，且随辐照剂量的增加，细胞活力逐渐减少。中高剂量组单次辐照后24h细胞存活率均<100%，其中3.6Gy组的损伤程度有统计学意义（p<0.05）；照后48h、72h各剂量组的细胞活力随着辐照剂量的增加而降低，且各剂量组的损伤程度均有统计学意义（p<0.05），其中3.6Gy、4.8Gy、6.0Gy组有显著差异（p<0.01）。实验结果表明中高剂量X射线对HUVEC细胞有损伤，且损伤程度与辐照剂量、损伤时间存在一定的量效关系。（二）染料木黄酮对大剂量X线辐射所致HUVEC损伤的防护作用染料木黄酮以0、5、20、50μmol/L分别于辐照前2h预作用于HUVEC细胞，3.6Gy、6.0Gy X射线辐射后24、48h检测细胞内SOD、ROS及GSH-Px的水平变化。实验结果显示与正常对照组比较，单纯辐照组HUVEC细胞内SOD、GSH-Px的含量显著降低（P<0.01）,ROS含量显著增加（P<0.01），且随着辐照剂量的增加变化越明显；与单纯辐照组相比，染料木黄酮干预组能明显改善辐射诱导的氧化应激引起的损伤，显著降低ROS含量，提高SOD活性（P<0.01）。在一定浓度范围内，防护作用随着染料木黄酮浓度的增加而增强，且染料木黄酮对3.6Gy辐照剂量下的防护效果要优于6.0Gy辐照剂量。与单纯辐照组相比，染料木黄酮各浓度组细胞内GSH-Px水平无显著变化（P>0.05）。实验结果表明染料木黄酮有一定的抗辐射作用，在一定浓度范围内其防护效果呈现浓度依赖性。（三）染料木黄酮对大剂量X线所致HUVEC细胞损伤防护机制的研究细胞自身的损伤反应机制涉及周期阻滞、凋亡或DNA修复等信号的传导有赖于磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）相关的蛋白激酶家族的调节，该类蛋白激酶对细胞周期、DNA修复以及细胞凋亡起着调控作用；AKT是PI3K直接作用的下游靶点，PI3K/AKT形成的通路是细胞内重要的存活信号通路，它可以通过直接或间接介导转录因子和细胞因子的转导过程，调控细胞增殖、分化、凋亡以及肿瘤血管的生成。本部分实验将在基因和蛋白水平上检测受辐照HUVEC细胞周期的变化及PI3K/AKT信号通路在该过程中可能的作用机制。染料木黄酮以0、5、20、50μmol/L分别于辐照前2h预作用于HUVEC，以3.6Gy、6.0Gy X射线照射后于24、48h收集细胞，流式细胞仪检测细胞周期；收集3.6Gy、48h的细胞进行PCR及Western Blot，检测PI3K、AKT、CyclinB1mRNA和蛋白的表达。实验结果显示，与正常对照组细胞周期比较，HUVEC细胞经3.6Gy、6.0GyX线辐照后24h、48h，均出现明显的G2/M期阻滞，给予染料木黄酮防护后，24h、48h细胞G2期阻滞都有所缓解，表现为G2期细胞数量减少，S、G1期细胞数量有所增加，不同的是照后24h染料木黄酮浓度在20μmol/L时对缓解G2/M期阻滞作用最好，而照后48h最佳防护浓度则是5μmol/L。PCR结果显示，与正常对照组细胞比较，HUVEC细胞经3.6Gy X线照射后48h PI3K mRNA的表达略有增加，AKT mRNA的表达显著增加（p<0.01），细胞周期蛋白B（CyclinB1）mRNA的表达略增加；给予染料木黄酮防护后，PI3K mRNA较模型组（M）均有所增加，但无差异（p>0.05），AKT mRNA较模型组（M）均降低，浓度组间有差异（p<0.05），CyclinB1mRNA较模型组（M）均增加，但无差异（p>0.05）。Western Blot结果显示，与正常对照组细胞比较，HUVEC细胞经3.6Gy X线照射后48h PI3K蛋白表达减少，AKT蛋白表达降低，活化AKT（p-AKT）蛋白表达含量则显著增加（p<0.01），cyclinB1蛋白表达则异常升高；给予染料木黄酮防护后，PI3K蛋白表达较模型组（M）增加，但浓度组之间无统计学差异（p>0.05）；AKT蛋白表达较模型组（M）下降（p<0.05），p-AKT的表达含量较模型组（M）升高（p<0.05）；cyclin B1表达增加。实验结果表明染料木黄酮能有效地抑制3.6Gy、6.0GyX线辐照HUVEC细胞引起的辐照损伤，对电离辐射致G2/M期阻滞有一定的缓解作用，可能与AKT信号通路的激活有关。