禽流感病毒(AIV),尤其是高致病性禽流感病毒是一种可以引起人兽共患病的病原,由其引发的禽流感疫情不仅给养禽业带来了严重打击,而且也对人类健康和生命安全带来了严重威胁。高致病性的H5N1和近年出现的H7N9新型流感病毒已经跨越种间屏障直接引起人类感染,并导致部分感染者死亡。H9N2亚型禽流感病毒作为一种低致病性禽流感病毒在我国广泛存在,与高致病性禽流感病毒相比,因其对养禽业和人类危害相比较小,因此,一直以来人们对其重视程度远不如H5N1亚型高致病性禽流感。随着H9N2亚型病毒的广泛流行与不断演化,该亚型禽流感病毒不仅可以在家禽和野鸟中分离到,而且已经具备了感染哺乳动物,甚至人的能力。2013年我国发生的人类H7N9亚型流感疫情及H10N8亚型流感病毒感染人的事件,引起了众多学者和政府的广泛关注。研究表明,新型H7N9和H10N8的内部基因来源于H9N2亚型AIV,表明H9N2病毒已经成为新型流感病毒的供给者,其在新型病毒产生上发挥了重要作用,故H9N2 AIV对人类健康是一个潜在的、极大的威胁。综合国内外对禽流感及其病毒的已有研究,主要集中在流行病学调查、分子生物学、发生机制、病原诊断和疫苗研制等,并已取得了一定的研究成果,但迄今为止,对禽流感的研究依然存在许多尚未解决的问题,尤其是针对某一具体特定地区(域)禽流感发生的系统研究报道较少。因此,本项目应用分子生物技术、免疫学、血清学等方法,通过对北方某省2012年-2014年14个市的养殖场、部分家禽交易市场和重点散养户养殖的鸡的禽流感流行情况调查、相关基因序列分析、分离毒株对小鼠的致病性等的较全面系统研究与分析,同时建立了适应基层养殖场现地快速、准确检测禽流感的RT-LAMP方法,为探索AIV在该省的流行情况,更好的防控AIV提供一定的技术支撑和科学依据。主要研究内容和结果如下:(1)北方某省养殖鸡禽流感流行情况调查应用荧光RT-PCR方法检测发现,来自于上述养殖场(户)被检的17940份鸡棉拭子样品和315份组织器官样品中,组织脏器样品中检测出H5N1亚型禽流感样品2份;被检的2110份鸡棉拭子样品H7亚型禽流感病毒核酸检测均为阴性。被检的1560份鸡棉拭子样品和83份禽脏器样品中,棉拭子样品检测出H9N2亚型禽流感检出1户5份,场(户)阳性率为1.92%,样品阳性率为0.32%;禽脏器样品检出H9N2亚型禽流感10户35份,场(户)阳性率为12.05%,样品阳性率为11.11%;尽管在棉拭子样品中未检测到H5亚型禽流感病毒,但依然表明该省养殖的家禽存在一定的H5亚型和H9亚型禽流感病毒的感染。血凝抑制试验(HI)检测发现,该省H5亚型禽流感病毒免疫抗体平均合格率为80%以上,表明该省养殖场的鸡可达到对H5亚型禽流感病毒攻击的免疫保护作用。52个饲养场(户)的鸡群H9亚型禽流感病毒的免疫率仅为30.78%,而未免疫鸡群H9亚型禽流感病毒感染抗体阳性率高达75%,表明该省养殖鸡群有发生H9亚型禽流感的内在风险。(2)鸡群体禽流感免疫评价指标的建立及其意义为了更科学评价鸡群的免疫抗体水平,根据近3年该省养殖鸡的禽流感免疫抗体监测数据,研究建立了评价鸡群禽流感免疫状况的界差率(Q)指标。在雏鸡,当Q≥50%时,鸡群健康状态相对稳定;对蛋鸡而言,当Q≥100%时,不仅鸡群健康状态稳定,且对产蛋影响相比较小,即使由于某种因素导致的产蛋下降,其恢复也较快;而当q<50%时,鸡群健康状态极不稳定,提示应及时进行相应疫苗免疫。该评价指标与现行指标相比能更全面反映鸡群的免疫水平以及在该免疫水平下,鸡群整体健康状态及可能存在的疾病风险,该评价体系对适时掌握鸡群禽流感免疫状态和免疫时机意义重大。(3)h5和h9亚型禽流感病毒的分离鉴定及基因序列分析1)h5亚型禽流感病毒的分离鉴定及基因序列分析通过对该省曾经流行过的两株毒株进行病毒分离鉴定,获得ck/ln/dl02/12和ck/ln/hs03/05两株h5n1亚型禽流感病毒,并分别对其做了全基因组序列测定及分析。结果发现:上述两株病毒的ha蛋白上的裂解位点均为连续的4~6个碱性的氨基酸,分别为rrrkr*g和rrrkkr*g均具有h5亚型高致病性禽流感病毒的特征。基因进化树分析显示,ck/ln/dl02/12属于clade2.3.2.1c分支,而ck/ln/hs03/05隶属于calde2.2分支,两株病毒的ha和na基因与野禽病毒同源性较大,由此推断两株病毒可能来源于野禽。两株病毒的pb2蛋白627位点存在明显差异,其中,ck/ln/dl02/12毒株的627位点为e,ck/ln/hs03/05毒株的627位点突变为k。2)h9亚型禽流感病毒的分离鉴定及基因序列分析通过对检测到的h9阳性样品进行病毒分离鉴定,共获得10株h9n2亚型禽流感病毒,经全基因组序列测定分析发现,ha蛋白的裂解位点均为典型的低致病性禽流感病毒分子生物学特点,但10株h9n2病毒ha蛋白的226位点均已由原来的谷氨酰胺(q)变异为亮氨酸(l)。而决定禽流感病毒对哺乳动物致病性和传播能力的pb2蛋白的627位和701位均未见突变。na蛋白中292位氨基酸均为精氨酸(r),但有多株分离病毒的m2蛋白的31位点发生了突变。病毒的内部基因与2013年的h7n9新型流感病毒高度同源,根据遗传演化关系,可将分离的10株h9n2病毒划分为5个基因型。即基因1型有4株,基因2型和基因5型各1株,基因3型和4型各2株。(4)h5和h9亚型禽流感病毒对小鼠的致病性1)h5亚型禽流感病毒对小鼠的致病性为了研究该省两株h5n1clade2.2分支和clade2.3.2.1c分支病毒对哺乳动物的致病性,以106eid50/50μl的病毒剂量对balb/c小鼠进行感染性实验。结果发现,上述两株病毒均可以在感染小鼠的肺脏中高水平复制,被感染小鼠的体重均大幅度下降,且导致一定数量的死亡。根据病毒在小鼠脑、脾和肾等脏器中的复制情况发现:ck/ln/hs03/05毒株对小鼠的致病性较高,感染3天,不仅能在肺脏内高效复制,而且在脑、肾、脾脏中均有一定的复制能力;而ck/ln/dl02/12毒株感染3天,仅能在小鼠肺脏中得到高拷贝复制,在其余被检器官内未发现病毒的复制。表明两株h5n1亚型禽流感病毒均可感染小鼠,但是致病性存在一定差异。2)h9亚型禽流感病毒对小鼠的致病性为了探究该省鸡的h9n2亚型禽流感病毒对哺乳动物以及人类的潜在感染能力,以106eid50/50μl的病毒剂量经鼻腔感染babl/c小鼠。结果发现,ck/ln/pj03/12、ck/ln/sy03/12、ck/ln/fx04/12、ck/ln/ly04/12毒株可在小鼠的肺脏中稳定复制,而ck/ln/sn02/12和a/ck/sz02/13毒株感染小鼠后3天时在肺脏内有少量复制,于第6天被清除。ck/ln/a10/14和ck/ln/tl01/13毒株对小鼠不具有感染性。表明分离获得的10株H9N2亚型禽流感病毒对小鼠的致病性并不完全一致,呈现出不感染小鼠和仅感染小鼠肺脏的低致病性禽流感病毒的生物学特征。(5)禽流感病毒通用型环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法的建立及其应用根据环介导等温扩增技术(LAMP)原理,设计了4个针对AIV M基因保守片段的特异性引物,并对其反应条件进行了优化:结果表明,该反应体系的最佳优化组合为:内外引物浓度比例为8:1,Mg2+浓度为8mmol/L,反应时间30min。应用上述RT-LAMP反应条件,对H1~H16亚型AIV进行检测,其结果均为阳性,而对禽类其他主要病毒(NDV、IBV、IBDV、ILTV、ALV)无交叉反应,表明该方法具有良好的特异性。应用浊度仪分别对H1、H5、H7、H9四种常见亚型的禽流感病毒进行检测,其灵敏度均为10-6。选取一株病毒分别应用普通RT-PCR,荧光RT-PCR,RT-LAMP方法进行检测,结果表明,RT-LAMP的最低检测限度为13.43EID50/m L,敏感性比普通RT-PCR高10倍;对疑似禽流感样品的检测结果表明,该检测方法与RT-PCR和荧光定量RT-PCR方法检测的符合率均为81.8%。该研究为鸡群AIV感染的临诊检测和流行病学调查提供了一个快速、简便、实用的新技术。