目的:　　人线粒体蛋白mitoNEET是新近发现的由核基因编码的定位在线粒体外膜上的低分子量蛋白，其含有一个[2Fe-2S]型铁硫中心，该铁硫中心由Cys72、Cys74、Cys83及His87四个氨基酸残基配位结合。MitoNEET作为抗2型糖尿病药物吡格列酮的靶蛋白而被发现，广泛分布于真核和原核生物系统中，其可能参与多种生命活动过程，包括细胞自噬、凋亡、老龄化、糖尿病及体内活性氧的平衡等。体外实验中，mitoNEET蛋白可以直接将铁硫簇传递给目的蛋白，如fdx、aconitase1等;但其在细胞水平线粒体内外铁硫簇传递中的作用仍不是很清楚。本实验通过研究细胞中mitoNEET不同表达情况下线粒体内外铁硫簇水平变化，从而分析mitoNEET在细胞线粒体内外铁硫簇转运中的作用。　　方法:　　1.构建mitoNEET干扰质粒载体pGPU6/GFP/Neo-mitoNEET。培养人乳腺癌MCF-7细胞与肝癌HepG2细胞，分别筛选其G418最低药物致死浓度。在MCF-7和HepG2细胞中转染mitoNEET干扰质粒及其对照空载，通过G418药物筛选出稳定低表达mitoNEET及其对照细胞株。　　2.用荧光定量PCR和western blot测定细胞内mitoNEET mRNA和蛋白表达水平，挑选和鉴定最佳干扰效果的稳定低表达mitoNEET及其对照细胞株。　　3.用CCK8细胞增殖实验测定低表达mitoNEET及其对照细胞株的细胞增殖速率，分析低表达mitoNEET对细胞增殖的影响。　　4.测定稳定低表达mitoNEET及其对照细胞株线粒体内的铁硫蛋白活性和蛋白表达情况，从而反映线粒体内铁硫簇水平，包括aconitase2、complexⅠ和硫辛酸合成酶。同时测定细胞质中的铁硫蛋白活性和蛋白表达情况以反映细胞质铁硫簇水平，包括acoritase1和二氢嘧啶脱氢酶。比较低表达mitoNEET及其对照细胞株的细胞线粒体内外铁硫簇水平差异，从而分析mitoNEET蛋白在细胞线粒体铁硫簇转运中的作用。　　5.构建重组mitoNEET野生型高表达质粒，用于后续细胞转染。在MCF-7细胞中转染mitoNEET野生型高表达质粒使细胞高表达mitoNEET，用荧光定量PCR和westemblot鉴定此时细胞内mitoNEET mRNA和蛋白表达水平。　　6.转染mitoNEET野生型高表达质粒及其对照质粒，48h后测定细胞内aconitase1、2的蛋白表达水平和酶活性，从而检测高表达mitoNEET对细胞线粒体内外铁硫簇水平变化的影响。　　7.利用定点突变构建mitoNEET突变型高表达质粒(H87C和H87S)。在稳定低表达mitoNEET细胞株中转染mitoNEET野生型和突变型高表达质粒载体进行rescue实验。用荧光定量PCR和western blot鉴定细胞内mitoNEET mRNA和蛋白表达水平从而分析rescue对mitoNEET表达的恢复情况。　　8.在如上转染mitoNEET野生型和突变型(H87C和H87S)高表达质粒细胞中测定胞质aconitase1的蛋白表达和酶活性，分析rescue对mitoNEET细胞铁硫簇传递功能的影响。　　结果:　　1.稳定低表达mitoNEET细胞株的筛选、鉴定以及其对细胞增殖的影响。　　利用RNAi干扰技术和G418药物筛选获得稳定低表达mitoNEET细胞株及其对照细胞株。低表达mitoNEET细胞株的mitoNEET mRNA和蛋白表达均显著性的低于未处理和对照细胞株。另外相对于未处理和对照细胞株，mitoNEET低表达细胞的细胞增殖速率显著性的下降。　　2.低表达mitoNEET对线粒体内外铁硫簇水平的影响。　　低表达mitoNEET不影响线粒体内aconitase2的蛋白表达水平和酶活性，同时complexⅠ和硫辛酸合成酶的酶活性也没有明显的变化。另一方面，低表达mitoNEET后细胞质中aconitase1蛋白表达不变，而其酶活性显著降低。但是细胞质中的二氢嘧啶脱氢酶的酶活性在低表达mitoNEET之后并没有显著性变化。　　3.高表达mitoNEET对线粒体内外铁硫簇水平的影响。　　通过在MCF-7细胞中瞬时转染高表达mitoNEET的野生型质粒载体从而构建高表达mitoNEET细胞模型，其mitoNEET mRNA和蛋白表达相对于对照细胞显著性的增加。高表达mitoNEET对细胞线粒体内外aconitase1、2的酶活性和蛋白表达水平均没有明显影响。　　4.Rescue对mitoNEET细胞铁硫簇转运功能的影响。　　在稳定低表达mitoNEET细胞株中瞬时转染高表达mitoNEET野生型质粒和突变型质粒(H87S、H87C)均使细胞内mitoNEET mRNA和蛋白表达显著性的增加。转染野生型质粒的细胞可以恢复aconitase1的酶活性同时不影响其蛋白表达;转染突变型质粒的细胞(H87C和H87S)虽然能使细胞中mitoNEET的mRNA和蛋白表达水平恢复，但是不能使之前低表达mitoNEET导致降低的aconitase1酶活性恢复，同时此过程中aconitase1的蛋白表达也没有明显变化。　　结论:　　本实验成功构建了稳定低表达mitoNEET和其对照细胞株。MitoNEET会抑制细胞增殖速率。低表达mitoNEET不影响细胞质中aconitase1蛋白水平而降低其酶活性，对其他线粒体内外铁硫蛋白活性无明显影响。结果表明mitoNEET参与传递细胞铁硫簇给细胞质中的aconitase1。　　高表达mitoNEET不影响线粒体内外铁硫簇水平，aconitase1、2的蛋白表达和酶活性均没有显著变化。表明细胞中正常表达的mitoNEET已能够发挥其铁硫簇传递功能，过表达对其细胞铁硫簇传递功能没有影响。　　在低表达mitoNEET细胞株中转染野生型mitoNEET表达质粒的细胞可以恢复其细胞质的aconitase1的酶活性同时不影响该蛋白表达。转染mitoNEET突变型(H87C和H87S)表达质粒的细胞虽然能使细胞中mitoNEET mRNA和蛋白表达水平恢复，但是不能使之前低表达mitoNEET导致aconitase1的酶活性降低恢复，同时此过程中aconitase1的蛋白表达也没有明显变化。结果进一步验证mitoNEET参与将铁硫簇传递给aconitase1，且His87是其重要的活性位点。His87突变可以使mitoNEET失活从而影响其细胞铁硫簇传递功能。