植物在整个生活史过程中会受到多种逆境因素的影响。为了抵御这些不利因素,植物会启动一系列的抗胁迫反应来维持自身的生长发育。研究表明,对植物细胞凋亡的抑制作用是植物抗胁迫的重要机制之一。GAAP1是TMBIM家族的成员,它能帮助植物抵御盐胁迫和ER-stress诱导的细胞凋亡。然而,GAAP1参与植物抗胁迫和细胞凋亡的机理及其是否受到其他因子的调控还很不清楚。蛋白与蛋白之间的相互作用是调控蛋白质功能的重要方式之一。因此,筛选和鉴定与其相互作用的互作因子对于研究调控GAAP1功能的机理具有重要意义。本实验室前期利用酵母双杂交系统筛选出多个GAAP1的潜在互作因子,本论文利用荧光定位和GST-pull down等技术对这些因子是否能够与GAAP1相互结合进行了验证。此外,本论文通过构建互作因子的功能缺失突变体来研究其在植物生长发育及抗胁迫过程中的功能。主要研究结果如下：1.在烟草叶肉细胞中,GAAP1能与其潜在互作因子AtWLIM2b, MAPR3和PAS共定位。通过构建带有不同荧光标签蛋白的GAAP1、AtWLIM2b、MAPR3和PAS表达载体,采用烟草叶片瞬时转化系统和荧光显微观察,结果显示,GAAP1主要定位于烟草叶肉细胞的细胞膜上。AtWLIM2b, MAPR3和PAS也都主要定位于烟草叶肉细胞的细胞膜上并与GAAP1存在共定位现象,说明GAAP1可能与AtWLIM2b、MAPR3和PAS存在相互作用。2. GST-GAAP1纯化蛋白能够pull down烟草叶片中表达的AtWLIM2b、MAPR3和PAS蛋白。构建了植物中表达的AtWLIM2b-TAP、MAPR3-TAP和PAS-TAP融合蛋白的载体,以及原核表达表达载体GST-GAAP1。通过体外GST-pull down实验的结果显示,GST-GAAP1蛋白能够将烟草叶片中表达的AtWLIM2b-TAP、MAPR3-TAP和PAS-TAP蛋白pull down下来,说明GAAP1能够在体外非生理条件下直接与AtWLIM2b、MAPR3和PAS相互作用。3. ER-stress诱导因子TM能够影响GAAP1和AtWLIM2b在拟南芥细胞中的亚细胞定位。分别构建了YFP-GAAP1和YFP-AtWLIM2b在拟南芥中的稳定转化子,荧光定位观察结果显示,在拟南芥根细胞中,GAAP1主要细胞膜上。TM处理后,GAAP1的表达量和定位没有发生明显的变化。而在叶肉细胞中,GAAP1主要在叶绿体中表达且TM能够诱导GAAP1表达的上调。此外,TM处理后GAAP1的定位由叶绿体内转移到叶绿体外。这些结果提示GAAP1能够参与调控拟南芥叶肉细胞的抗ER-stress反应。AtWLM2b在根部细胞中主要定位于细胞核和细胞膜上。TM处理后,AtWLIM2b在细胞核中的荧光有所减弱。而在叶肉细胞中,AtWLIM2b主要存在于叶绿体和细胞膜上。TM处理后,eYFP-AtWLIM2b的荧光强度和定位基本不变。这些结果表明,GAAP1和AtWLIM2b在拟南芥细胞定位和对ER-stress的反应有一定的区别,暗示了二者功能可能存在差异。4. AtWLIM2b基因单独缺失突变不影响拟南芥对NaC1、TM或DTT的抗胁迫反应。鉴定了拟南芥AtWLIM2b基因缺失突变体Atwlim2b-1。结果表明,AtWLIM2b基因单独缺失突变不影响NaC1、TM和DTT对拟南芥的胁迫作用。5. MAPR3功能缺失抑制拟南芥主根的生长和真叶的发生。鉴定了拟南芥MAPR3基因缺失突变体mapr3.结果表明,MAPR3功能缺失能抑制拟南芥主根的生长和真叶的发生。这提示MAPR3可能参与调控拟南芥的早期发育。6. AtWLIM2b缺失突变能够抑制GAAP1缺失突变对拟南芥早期发育的影响。构建并鉴定拟南芥GAAP1/AtWLIM2b双突变纯合子,分析GAAP1/AtWLIM2b双突变对拟南芥早期发育的影响。结果显示,GAAP1突变能够抑制拟南芥种子的萌发及真叶的发生,这表明3AAP1参与调控拟南芥的早期发育过程。AtWLIM2b突变能够显著降低GAAP1突变对拟南芥种子萌发及真叶发生的抑制作用。这提示ATWLIM2b是拟南芥早期发育的抑制因子,而GAAP1能够通过与其相互作用并抑伟AtWLIM2b的功能进而调控拟南芥的早期发育。总之,利用荧光显微成像和GST-pull down的方法,验证了GAAP1与AtWLIM2b、MAPR3和PAS在植物细胞中的相互作用。AtWLIM2b、MAPR3突变不显著影响拟南芥的抗胁迫反应。MAPR3和GAAP1突变能抑制拟南芥的早期发育,提示其参与调控拟南芥的早期发育。此外,AtWLIM2b突变能够补救GAAP1突变导致的拟南芥早期发育的抑制作用,暗示AtWLIM2b是拟南芥早期发育的抑制因子,而GAAP1可能通过与其相互作用进而抑制AtWLIM2b对拟南芥早期发育的影响。