研究背景骨关节炎(OA)是我国四大老年病之一，但发病机制至今尚未明确。目前研究资料显示，OA的致病过程受多种基因的调控，涉及多种分子，并形成网络系统。正常关节软骨和滑膜细胞均分泌多种生长因子及细胞因子。当软骨出现病变的时候，滑膜细胞有关这些细胞因子及生长因子的分泌和表达也随之出现异常。一氧化氮(NO)是OA致病的重要介质，OA病人滑膜及关节软骨是产生NO的重要来源。应用诱导型一氧化氮合酶(iNOS)抑制剂可明显改善OA关节的损害程度。由于这些分子不是通过单一的功能发挥作用，而是相互作用、相互影响。liquichip workstation液相蛋白芯片系统是一种新型的蛋白质研究平台，可以同时对同一样品中的多个不同的分子同时进行检测，横向比较这些因子间的关联性，从而筛选出OA相关致病关键因子。本课题采用体外培养OA滑膜细胞，应用酯多糖(LPS)作为刺激因素诱导滑膜细胞表达iNOS，采用iNOS抑制剂氨基胍(AG)作为干涉因素，研究NO对OA滑膜细胞相关因子表达的影响，了解NO与多种细胞因子表达的相互关系。研究目的应用LPS诱导滑膜细胞表达iNOS，通过AG抑制iNOS的活性，调节OA滑膜细胞产生NO，检测不同NO浓度下，OA滑膜细胞多种细胞因子表达情况，并探讨它们与NO之间的相关关系。研究方法1、采集髋、膝OA患者关节滑膜，体外培养滑膜细胞。用抗vimentin抗体作免疫组化染色，鉴定。LPS浓度分为4组分别为0、1、10、100mg／L组。20mg／L LPS加入4组浓度分别为0、0.1、1、10 mmol／L AG，收集培养液上清液。测量不同浓度LPS诱导下培养上清液中iNOS的含量变化和同一浓度LPS加不同浓度AG培养上清液中NO的含量变化。2、培养滑膜细胞，分成4组：滑膜细胞空白；滑膜细胞+LPS 20mg/L；滑膜细胞+AG 1mmol／L；滑膜细胞+LPS 20ug／L+AG 1mmol／L。根据分组分别加入LPS和AG，继续培养48h后，收集培养液上清。检测各组NO浓度。用液态蛋白芯片技术对上清液基质金属蛋白酶(MMP)-1.3.9进行检测。了解NO浓度对OA滑膜细胞MMP-1.3.9表达的影响，并推测它们与NO之间的相关关系。3、培养滑膜细胞，分成4组：滑膜细胞空白；滑膜细胞+LPS 20mg／L；滑膜细胞+AG 1mmol／L；滑膜细胞+LPS 20ug／L+AG 1mmol／L。对不同分组的OA滑膜细胞培养上清液，检测各组NO浓度。用液态蛋白芯片技术对上清液IL-6、TGF-β、VEGF进行检测，了解NO浓度对OA滑膜细胞白细胞介素(IL)-6、转化生长因子(TGF)-β、血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达的影响，并推测它们与NO之间的相关关系。4、所测数据以(?)±S表示，统计用SPSS10.0软件。各组数据比较：先进行方差齐性检验，如方差齐，则采用完全随机设计的单因素方差分析及多组均数间的LSD法检验；否则，则采用完全随机设计的非参数Kruskal-Wallis检验，P≤0.05为有统计学差异。相关分析，采用Pearson相关分析，P≤0.05为有统计学差异。结果1、组织块原代培养3天后，可见细胞从滑膜组织块边缘逸出。2～3周形成密集的单层细胞铺满瓶壁，部分区域呈堆积样或漩涡状生长。培养细胞经过两～三次传代后，大部分为成纤维细胞样细胞，经免疫组化鉴定可达95％以上。在未加入LPS组，培养上清中iNOS的含量极低，与培养基对照组比较无明显差异(P=0.295)。加入LPS后，iNOS的含量随加入的LPS的浓度的增加而逐渐增加(P＜0.05)。滑膜细胞在LPS诱导下，加入不同浓度的AG，随加入的AG浓度的增加，NO表达的量逐渐减少(P＜0.05)。2、滑膜细胞+AG组NO浓度与滑膜细胞空白组比较无显著性差异(P=0.089)。滑膜细胞+AG组、滑膜细胞空白组与滑膜细胞+LPS组、滑膜细胞+LPS+AG组比较有显著性差异(P＜0.001)。滑膜细胞+AG组、滑膜细胞空白组与滑膜细胞+LPS组MMP-1浓度比较有显著性差异(P＜0.05)。余各组MMP-1浓度两两较无显著性差异(P＞0.05)。MMP-1浓度与NO浓度间的相关关系分析，r=0.782，P＜0.001，存在正相相关关系。滑膜细胞+AG组MMP-3浓度与滑膜细胞空白组比较无显著性差异(P＞0.05)。滑膜细胞+AG组、滑膜细胞空白组与滑膜细胞+LPS组、滑膜细胞+LPS+AG组比较有显著性差异(P＜0.05)。MMP-3浓度与NO浓度间的相关关系分析，r=0.868，P＜0.001，存在正相相关关系。滑膜细胞+AG组、滑膜细胞空白组、滑膜细胞+LPS组及滑膜细胞+LPS+AG组MMP-9浓度比较无显著性差异(F=0.105；P＞0.05)。MMP-9浓度与NO浓度间的相关关系分析，r=0.126，P=0.596，两者间无相关关系。3、滑膜细胞+AG组IL-6浓度与滑膜细胞空白组比较无显著性差异(P=0.497)。滑膜细胞+AG组、滑膜细胞空白组与滑膜细胞+LPS组、滑膜细胞+LPS+AG组IL-6浓度比较有显著性差异(P＜0.05)。IL-6浓度与NO浓度间的相关关系分析，r=0.879，P＜0.001，存在正相相关关系。滑膜细胞+AG组TGF-β浓度与滑膜细胞+空白组比较无显著性差异(P=0.211)。滑膜细胞+AG组、滑膜细胞空白组与滑膜细胞+LPS组、滑膜细胞+LPS+AG组比较有显著性差异(P＜0.05)。TGF-β浓度与NO浓度间的相关关系分析，F=-0.818，P＜0.001，存在负相相关关系。滑膜细胞+AG组、滑膜细胞+空白组、滑膜细胞+LPS组及滑膜细胞+LPS+AG组VEGF浓度比较无显著性差异(F=0.6845，P=0.575)。VEGF浓度与NO浓度间的相关关系分析，r=0.165，P=0.488，无明显相关关系。结论1、滑膜细胞在体外培养体系中，在正常情况下仅有少量的NO及iNOS表达，而加入LPS后，滑膜细胞NO及iNOS的表达明显增加。而再加入AG后，能有效的抑制滑膜表达NO及iNOS。AG为iNOS特异性抑制剂，不是完全抑制NO生成。2、滑膜细胞培养体系中，NO与MMP-1、3的表达有正相关关系，与MMP-9无明显相关关系。3、滑膜细胞培养体系中，NO与IL-6的表达有正相关关系，与TGF-β的表达有负相关关系，TGF-β可能是OA的一种保护因子。NO与VEGF无明显相关关系。4、滑膜细胞在炎性因子刺激下，可增加NO的含量，进而增加MMP-1.3、IL-6的表达，促进OA的发展。抑制NO的产生，可以减少MMP-1.3、IL-6的表达，进而起到延缓OA发生的作用。