病理性疼痛,包括炎性病理性痛和神经病理性痛,作为临床实践和基础科学研究的重大挑战,一直是全球范围内造成失能的首要元凶,严重影响着病人的机体功能和生活质量,给家庭和社会带来了巨大的经济负担。临床上现有的药物,如非甾体类消炎药、阿片类药、抗抑郁药和抗惊厥药等,所产生的镇痛效果均不尽人意且多多少少存在副作用,严重限制了病理性疼痛的治疗。因此,深入开展病理性痛的机制研究,开发新的靶向镇痛药物具有十分重要的临床意义。尽管过去几十年里对疼痛的研究取得了一些瞩目成就,但对病理性痛发生与维持的认识仍然远远不足。近来,不断有研究发现外周和中枢神经系统内的胶质细胞在病理性痛中发挥重要作用。通过自身的激活与增殖并释放大量的细胞因子和趋化因子,胶质细胞介导了病理性痛状态下的多种神经生物学变化,包括神经元超兴奋,神经毒性以及神经炎症等,参与了外周和中枢敏化的形成,最终导致疼痛的发生发展。基质细胞衍生因子SDF1是趋化因子CXC家族的一员,广泛分布于外周和中枢神经系统。通过结合其同源性受体CXCR4,SDF1参与调节神经元和胶质细胞的多种活动。最近,不断有行为药理学研究提示SDF1-CXCR4信号系统与疼痛的发生相关。然而,这些研究大都浅尝即止,不足以揭示SDF1-CXCR4信号参与病理性疼痛发生与维持的真正机理。此外,不同的病理性痛状态下,不同部位的SDF1-CXCR4信号通路的作用依然不清。本课题采用具有代表性的急性外周炎性痛,急性痛向慢性痛转变以及慢性中枢神经病理性痛三种疼痛模型,综合利用分子生物学,行为药理学和电生理记录等手段,系统地研究SDF1-CXCR4信号在不同类型病理性疼痛发生与维持中的作用。通过实验,我们得到以下结果:一、SDF1-CXCR4信号通路参与急性炎性痛的发生与维持大鼠足底注射蜜蜂毒(bee venom,BV)溶液后,同侧腰段背根神经节内SDF1和CXCR4的蛋白表达水平明显升高。免疫荧光双标结果显示CXCR4几乎表达于所有大、中、小型初级传入神经元的胞体,包括IB4免疫阳性的非肽能,P物质免疫阳性的肽能以及TRPV1免疫阳性的初级伤害性神经元,然而上调的SDF1仅特异性地分布于GFAP免疫阳性的卫星胶质细胞中。全细胞膜片钳记录显示BV溶液注射后大鼠同侧腰段背根神经节内中小型伤害性神经元的兴奋性显著增加,表现为神经元放电频率的增加以及动作电位产生基强度的减小,而利用CXCR4受体的选择性阻断剂AMD3100孵育背根神经节可明显翻转伤害性神经元的超兴奋现象。进一步的研究发现BV溶液注射后大鼠背根神经节内电压依赖性离子通道Nav1.8以及磷酸化ERK的蛋白表达水平也显著上调。在BV溶液注射前10分钟,于足底注射AMD3100或者ERK信号的特异性抑制剂U0126显著抑制Nav1.8的上调以及ERK信号的激活。同样地,鞘内预先注射U0126亦有效地抑制BV注射引起的Nav1.8和磷酸化ERK表达水平的增加。行为学结果显示足底预先注射AMD3100能剂量依赖性地抑制BV溶液诱致的原发性机械性痛敏和热痛敏以及自发性痛行为,而对大鼠的镜像热痛敏无显著作用。同样地,鞘内预先注射U0126也能有效抑制BV溶液引起的多种痛相关行为,包括镜像热痛敏。此外,我们发现足底注射Nav1.8的特异性阻断剂A-803467不仅能抑制BV溶液引起的自发性痛缩足反应,而且还能翻转其诱致的原发性机械性痛敏和热痛敏。二、SDF1-CXCR4信号通路参与急性痛向慢性痛状态的转变大鼠足底注射BV溶液后引起明显的原发性机械性痛敏,该痛敏在注射后2小时最明显,随后逐渐减轻直到注射后96小时完全消失,提示BV溶液注射引起一个短暂的急性炎性痛模型。随后,BV溶液注射后的第7天,我们在大鼠足底相同的位置再次注射前列腺素溶液,发现前列腺素注射亦引起明显的原发性机械性痛敏并持续超过24小时,然而在正常大鼠足底注射相同剂量的前列腺素溶液引起的机械性痛敏却较短暂不超过4小时,提示BV预先注射能显著增强前列腺素的致痛作用,这一现象被称为痛敏预点燃(hyperalgesic priming,HP)现象。通过扩大上述两种致痛剂注射之间的时间窗,我们发现BV引起的HP现象至少持续21天不变。利用外周足底预先注射AMD3100或背根神经节内注射CXCR4受体siRNA的方法,我们发现BV溶液诱致的原发性机械性痛敏被显著抑制,且HP现象也被有效阻断,表现为大鼠前列腺素注射后4和24小时的机械性痛阈明显升高。随后,我们于大鼠足底注射重组的SDF1蛋白溶液,发现单独给予SDF1注射足够引起原发性机械性痛敏且呈剂量依赖性,该痛敏在注射后半小时即出现持续不超过72小时。类似于BV注射,单独的SDF1注射同样可引起HP现象,表现为SDF1足底注射5天后再次注射前列腺素所引起的机械性痛敏的持续时间延长超过24小时。预先外周药理学阻断或背根神经节内下调CXCR4受体均能有效抑制SDF1引起的机械性痛敏和HP现象。免疫印迹结果显示足底注射SDF1后背根神经节内的磷酸化ERK和AKT蛋白的表达明显增多。预先于足底注射U0126或AKT信号通路的选择性阻断剂LY294002均能显著抑制SDF1引起的原发性机械性痛敏,且对SDF1引起的HP现象亦有效,表现为SDF1注射5天后再次注射前列腺素引起的机械性痛敏减轻。随后,在大鼠足底预先注射蛋白翻译表达的抑制剂temsirolimus或cordycepin,我们发现这两种药物均能抑制SDF1注射引起的原发性机械性痛敏和HP现象,提示局部的蛋白表达合成参与了原发性机械性痛敏和HP现象的形成。最后,采用完全弗氏佐剂引起的慢性炎性痛模型和坐骨神经分支结扎引起的慢性外周神经病理性痛模型,我们发现预先于背根神经节内注射CXCR4受体siRNA能显著抑制慢性痛敏的发生,而于造模后再行背根神经节内注射CXCR4受体siRNA能有效翻转慢性痛敏,提示SDF1-CXCR4信号参与慢性痛的发生与维持。三、SDF1-CXCR4信号通路参与中枢卒中后疼痛的发生与维持大鼠丘脑腹后外侧核团VPL内注射IV型胶原酶诱导丘脑出血性卒中后引起明显的双侧后足机械性痛敏,该痛敏在注射后7天稳定出现并至少维持28天不变,提示慢性中枢卒中后疼痛(central post stroke pain,CPSP)实验大鼠模型成功建立。免疫荧光及免疫印迹结果显示胶原酶注射后丘脑出血损伤周边区的小胶质细胞和星型胶质细胞大量激活,表现为Iba-1和GFAP的蛋白表达显著增加,于出血后3天开始,7天达峰值并至少持续28天。为探讨激活的胶质细胞在CPSP中的作用,我们在丘脑出血后的第10天再行小胶质细胞特异性抑制剂米诺环素和星型胶质细胞选择性抑制剂氟代柠檬酸的丘脑内出血部位注射,发现两种抑制剂均能翻转丘脑卒中后的双侧机械性痛敏,米诺环素的镇痛效果于注射后6小时达峰值且持续时间相对较长维持7天左右,而氟代柠檬酸单次注射的镇痛效果仅维持3天左右。随后,我们发现丘脑VPL内注射重组SDF1蛋白同样能引起大鼠双侧后足的机械性痛敏。与对照组相比,预先注射AMD3100或米诺环素或氟代柠檬酸均能有效抑制SDF1丘脑内注射引起的双侧机械性痛敏,提示SDF1-CXCR4信号通过激活胶质细胞引起机械性痛敏。紧接着,我们利用免疫印迹以及免疫酶联吸附技术观察了SDF1的蛋白表达变化,发现胶原酶注射后丘脑出血周边区域的SDF1表达上调且持续整个观察时间窗。线性相关分析显示卒中后大鼠的疼痛程度与SDF1表达的高低成正相关,提示SDF1可能在CPSP的发生中发挥重要作用。同样地,丘脑出血周边区域CXCR4受体的表达也持续上调,免疫双标结果显示CXCR4与NeuN,Iba-1和GFAP均有共存,提示神经元、小胶质细胞和星型胶质细胞均表达CXCR4受体。在胶原酶注射前,预先于丘脑内注射AMD3100显著抑制丘脑出血引起的损伤周边区小胶质细胞和星型胶质细胞的激活。此外,丘脑出血引起的促炎性细胞因子TNF-α,IL-6和IL-1β的高表达也被AMD3100所抑制。在丘脑出血后的第10天再行丘脑内注射AMD3100亦可翻转卒中引起的Iba-1和GFAP的高表达。此外,我们还发现AMD3100后注射还可显著翻转丘脑出血引起的神经元的超兴奋,表现为丘脑卒中引起的c-Fos的高表达被抑制。行为学研究显示,预先给予丘脑内注射AMD3100能抑制丘脑卒中后的双侧机械性痛敏。当丘脑卒中后疼痛稳定存在时,利用AMD3100后处理可成剂量依赖性地翻转大鼠双侧的机械性痛敏。进一步研究发现,胶原酶注射后丘脑出血损伤周边区低氧诱导因子HIF-1α的表达也明显增加,但持续时间较短仅在第3天时表达最高维持7天左右。利用丘脑内注射HIF-1α特异性抑制剂YC-1的方法,我们发现YC-1仅抑制丘脑出血引起的双侧机械性痛敏的产生,但并不能翻转已出现的卒中后机械性痛敏。此外,YC-1能有效抑制丘脑出血引起的SDF1,CXCR4以及Iba-1和GFAP蛋白的高表达。类似于胶原酶注射引起的脑卒中,丘脑内注射HIF-1α的诱导剂氯化钴同样能引起HIF-1α,SDF1,CXCR4以及Iba-1和GFAP蛋白表达的增加,而预先注射YC-1和AMD3100能显著抑制上述几种蛋白的上调。丘脑内注射氯化钴后引起短暂的机械性痛敏,表现为注射后第7天双侧后足的机械性痛阈显著下降,而AMD3100预先注射可抑制氯化钴引起的机械性痛敏的发生。结论1.外周急性炎性痛状态下,背根神经节卫星胶质细胞内SDF1表达显著增加,并作用于初级伤害性神经元表面上调的CXCR4受体,通过激活神经元内ERK信号通路引起电压依赖性离子通道Nav1.8的高表达,从而介导了卫星胶质细胞-初级伤害性神经元之间的对话,造成背根神经节内的神经炎症微环境,最终导致初级伤害性神经元的超兴奋以及多种炎性痛相关行为的维持。2.外周SDF1-CXCR4信号通路通过激活初级传入神经元细胞内ERK以及PI3K-AKT信号引起细胞内蛋白的翻译表达,介导了急性痛向慢性痛状态的转变,并最终参与慢性外周炎性痛以及慢性外周神经病理性痛的发生与维持。3.丘脑出血性卒中后的早期,损伤周边区低氧诱导因子HIF-1α大量激活,并介导SDF1和CXCR4蛋白表达显著增加。在出血后期,上调的SDF1-CXCR4信号通过介导小胶质细胞-星型胶质细胞-神经元之间的相互作用,引起大量促炎性因子的释放以及损伤周边区神经元的超兴奋,最终导致慢性CPSP的维持。