脂肪细胞的分化是极其复杂的生物学过程,在受到一系列转录因子级联调控的同时,各种细胞因子也能够通过复杂的信号转导,参与启动和调控脂肪细胞的分化和维持细胞特性。作为机体重要的内分泌器官之一,脂肪组织分泌的脂肪细胞因子对脂肪细胞的形成发挥着关键的调控作用。经研究证实,脂肪细胞因子的功能性紊乱会导致肥胖和胰岛素抵抗(Insulin Resistance, IR)等相关代谢疾病。除此之外,脂肪细胞因子还能参与调节家畜体脂沉积和肌肉发育等肉质性状。因此,深入研究脂肪细胞因子作用的分子机理,已成为阐明脂肪组织形成的重要组成部分,并对畜牧业生产的肉质改良有着重要意义。RBP4属于脂质运载蛋白家族成员,是视黄醇(维生素A)的特定转运蛋白。RBP4将肝脏储存的视黄醇转运到其他外周组织,并协助视黄醇发挥生理功能。研究发现RBP4作为脂肪细胞因子,能够参与调控脂肪细胞的葡萄糖吸收,并在机体IR中发挥重要作用。RBP4的新功能推动了病理与生理机制、脂肪细胞因子与炎症反应之间关系的探讨,使其成为药物开发的新靶标。但目前有关RBP4对脂肪细胞分化的机理研究相对较少。动物脂肪沉积与肌肉发育实验室前期研究发现,RBP4在同一品种猪的不同发育阶段的脂肪组织中表达差异显著,推测其可能在脂肪细胞分化过程中发挥重要作用。因此,为验证RBP4的细胞学功能,首先检测了RBP4在猪前体脂肪细胞分化过程中的时序表达；然后通过构建RBP4表达载体和干扰载体,外源增加或减少猪前体脂肪细胞中RBP4的表达量,采用油红O染色、real-time qPCR和Western blot等细胞分子生物学技术,从形态学和基因表达水平检测RBP4对猪前体脂肪细胞成脂分化的影响,为深入研究其在脂肪细胞分化过程中的作用机制奠定基础。此外,结合insulin刺激和insulin信号通路特异性抑制剂(LY294002)处理,进一步明确RBP4与insulin信号通路之间的互作方式及具体作用位点,为阐明RBP4参与调控insulin信号通路的作用机理提供参考依据。最后,通过对小鼠注射RBP4腺病毒,运用冰冻切片、免疫荧光和Western blot等研究技术,检测其对小鼠腹部脂肪组织的影响,对体外细胞实验进行补充和完善。获得了以下主要研究结果：1.在猪脂肪细胞形成过程中,RBP4随着脂质的积累表达升高,并且高表达于成熟脂肪细胞,主要存在于脂肪细胞的胞质中。2.构建猪RBP4基因腺病毒表达载体,并获得重组腺病毒Ad-RBP4,滴度可达到8.6×109pfu/ml,能够稳定增加猪前体脂肪细胞中RBP4的表达量。在此基础上,初步揭示了RBP4对猪前体脂肪细胞分化的抑制作用,主要体现在其降低了成脂关键基因的表达,同时增加了脂解基因ATGL和HSL的mRNA水平。3.构建猪RBP4基因慢病毒干扰载体,并获得重组慢病毒,滴度达到6.5×107pfu/ml。感染细胞后,能有效降低猪前体脂肪细胞内源性RBP4基因的表达(干扰效率在60%以上)。干扰RBP4能增加细胞内脂质积累,增加成脂基因表达,促进猪前体脂肪细胞分化。4.RBP4主要通过作用于AKT参与调节insulin信号通路,发挥其抑制成脂的作用。此外,在干扰RBP4的情况下,能够在一定程度上缓解胰岛素信号通路特异性抑制剂LY294002的抑制作用。在成熟脂肪细胞中,RBP4能够与AKT形成复合物。5.对小鼠进行腹腔注射Ad-RBP4,可以实现RBP4的异位表达。与对照组相比,RBP4可以减低小鼠腹脂的沉积速度,使其细胞直径下降。同时,RBP4能够通过抑制AKT的磷酸化,引起小鼠腹脂的胰岛素抵抗。本研究以猪前体脂肪细胞为实验材料,从正反两方面证实RBP4是脂肪细胞成脂分化的负调控因子。并结合体内体外的研究结果,验证了RBP4在脂肪细胞中造成胰岛素抵抗的机制足由于抑制了AKT的磷酸化,从而阻断了insulin信号通路。