生物胺(BA)是发酵过程中氨基酸脱羧产生的一种产物,在果酒中尤为常见,其中以组胺的含量最高,毒性最大。该论文研究了两种新的组胺降解酶,即来自植物乳杆菌的3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)和烯醇化酶。成功构建了两种不同的表达载体,实现了 GAPDH和烯醇化酶的异源表达和分离纯化,对两种酶的酶学性质进行了研究。1.以两种模式(带有和不带有组氨酸标签)构建了两种不同的表达载体,将GAPDH和烯醇化酶克隆并将重组质粒成功导入大肠杆菌宿主中。2.导入重组质粒的大肠杆菌成功进行了表达:未标记和标记的GAPDH在大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)中分别表达,带标签的烯醇化酶在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达。然后采用不同的纯化技术,不带组氨酸标签的GAPDH通过硫酸铵沉淀(最佳饱和度70%～80%)和Superdex 200凝胶过滤完成分离纯化,并得到纯酶。带标签的GAPDH和烯醇化酶破壁后通过Ni柱成功分离纯化,得到纯酶。未标记的GAPDH纯化2500倍,亚基分子量为36 kD,比活性为12.50 U/mg。鉴定出His-GAPDH具有39.9 kDa亚单位,1.93 U/mg的比活和45.2%的产率。烯醇化酶纯化了3.89倍,亚基分子量为51.58 kDa,6.20 U/mg的比活和22.7%的产率。3.对纯化的酶进行了酶学性质的研究。两种酶的最佳pH和温度分别为5.5和40℃。此外,GAPDH具有对高温敏感在70℃下几乎失活,在pH 5.5-8.5具有较高稳定性;它们耐酸,但对高温适度敏感。对于烯醇化酶而言在,最适温度在50℃,在20-70℃的温度范围内均能保持活性,对高温具有耐受性;在pH 7.5时具有最高活性,有广泛的pH抗性(pH4.5-9.5)4.乙醇和二氧化硫对重组的GAPDH与烯醇化酶的活性几乎没有影响。这些性质表明,重组GAPDH和烯醇化酶具有在酿酒行业中应用的潜力。