【摘 要】
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研究背景:膀胱癌（Bladder Cancer,BC）是一种常见的泌尿系统恶性肿瘤,其患病率逐年上升,并且呈现出年轻化的趋势。膀胱癌主要分为两种类型:非肌层浸润性膀胱癌（non-muscle-invasive bladder cancer,NMIBC）和肌层浸润性膀胱癌（muscle-invasive bladder cancer,MIBC）,两者占比分别约为70%～80%和20%～30%。在临床
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研究背景:膀胱癌（Bladder Cancer,BC）是一种常见的泌尿系统恶性肿瘤,其患病率逐年上升,并且呈现出年轻化的趋势。膀胱癌主要分为两种类型:非肌层浸润性膀胱癌（non-muscle-invasive bladder cancer,NMIBC）和肌层浸润性膀胱癌（muscle-invasive bladder cancer,MIBC）,两者占比分别约为70%～80%和20%～30%。在临床治疗中,经尿道膀胱切除术以及术后辅以卡介苗灌注是NMIBC最常用的治疗手段;MIBC的临床治疗策略则主要是通过手术切除患者的膀胱。尽管如此,因其具有较高的转移率,患者的术后5年生存率仍然较低,并且伴随着严重的不良反应。因此,开发更高效更安全的盆腔灌注药物具有重要意义。柴胡作为传统中草药,具有清热、保肝等作用。近年来,其活性提取物柴胡皂苷A（Saikosaponin A,SSA）也被证明具有消炎、抗肿瘤等作用。但对于治疗膀胱肿瘤,目前柴胡皂苷A的相关研究较少,其对膀胱肿瘤的作用及作用机制有待深入研究。目的:通过体内外实验探讨柴胡皂苷A对人膀胱癌细胞T24和5637的抑制作用,并进一步对其作用机制进行初探。方法:体外实验:1.细胞活力的测定:利用CCK-8试剂盒,选择不同浓度（0、3.75、7.5、15、30μM）的柴胡皂苷A处理人膀胱癌T24和5637细胞不同时间（12、24、48h）,然后检测各组细胞的存活率。2.利用划痕实验检测膀胱癌细胞在柴胡皂苷A（7.5μM）作用下迁移速率的变化。3.利用流式细胞仪检测柴胡皂苷A（0、3.75、7.5、15μM）作用于膀胱癌细胞24h后的凋亡率。4.利用蛋白质免疫印迹法检测Bad、Bak、Bcl-2和Caspase-3等细胞凋亡相关蛋白的表达变化。体内实验:1.建立裸鼠（BALB/c）皮下移植瘤动物模型,将30只裸鼠随机分为5组,分别为:荷瘤对照组（生理盐水）、低剂量组（2mg/kg）、中剂量组（5mg/kg）、高剂量组（10mg/kg）以及阳性对照组（吉西他滨）。2.向裸鼠腹腔内注射相应的溶液,每次注射间隔48h,注射次数共计12次。同时测量裸鼠肿瘤大小,观察各组裸鼠日常活动及精神状态,利用肿瘤体积测量值绘制皮下移植瘤的体积增长曲线。3.末次注射24h后,处死裸鼠,取出移植瘤,通过HE染色、蛋白质免疫印迹和免疫组织化学实验评价柴胡皂苷A对裸鼠皮下移植瘤的抑制作用以及对其机制进行研究。结果:1.CCK-8实验结果表明:柴胡皂苷A以时间和剂量依赖的方式抑制T24和5637细胞的增殖。2.无血清培养48h后,与对照组（0μM）相比,柴胡皂苷A（7.5μM）处理组的细胞迁移率明显降低,并且差异具有统计学意义。3.流式细胞术结果表明柴胡皂苷A能够诱导T24和5637细胞的凋亡,并且促进凋亡的能力随着作用浓度的增加而增强。4.柴胡皂苷A增强了 Bad和Bak等促凋亡蛋白的相对表达,降低了抑凋亡蛋白Bcl-2的相对表达,并且激活Caspase-9和Caspase-3,导致细胞凋亡。5.HE染色结果显示,药物干预后,移植瘤细胞增殖能力降低,肿瘤细胞逐渐发生肿胀,变性坏死的细胞增多。6.动物组织的蛋白免疫印迹实验和免疫组化的结果显示,经过药物处理,瘤体组织内与线粒体凋亡途径相关的促凋亡蛋白Bad,Bak等表达升高,Bcl-2等抑凋亡蛋白的表达降低。同时,Caspase-3、Bcl-2以及Bax的抗原阳性表达相较于生理盐水组有差异,并且差异有统计学意义。结论:1.柴胡皂苷A能够抑制膀胱癌细胞T24、5637细胞活力以及迁移能力,具有明显的时间和剂量依赖性。2.柴胡皂苷A在裸鼠体内外抑制5637肿瘤增殖以及影响Caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表达,其机制可能通过激活内源性线粒体细胞凋亡途径来实现对膀胱癌细胞的抑制作用。
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