【摘 要】
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棉酚(Gossypol)不仅是棉属植物体内一种重要的抗性物质;也是医药上具有重要应用价值的天然物质，具有重要的男性抗生育、抗肿瘤、抗病毒等作用。为了有效调控这一重要的次生代
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棉酚(Gossypol)不仅是棉属植物体内一种重要的抗性物质;也是医药上具有重要应用价值的天然物质，具有重要的男性抗生育、抗肿瘤、抗病毒等作用。为了有效调控这一重要的次生代谢产物，人们长期致力于棉酚及其储藏器官-色素腺体(Pigment gland)的研究。 从已构建完成的棉花色素腺体形成时期的cDNA均一化文库中筛选出一个棉花锌结合蛋白(Zinc binding protein-ZnBP)基因的全长cDNA序列。经过克隆，测序及序列分析，发现该片段包含一个完整开放阅读框，长654个碱基，编码217个氨基酸，蛋白分子量大小为24.6kD，等电点为9.33。推导的氨基酸序列(EU372997.1)与拟南芥锌结合蛋白(EFH46337.1)氨基酸序列同源性高达77％。以湘棉-18叶片基因组DNA为模板，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增分离获得棉花ZnBP基因的基因组序列。经测序分析，得到1731bp的棉花gDNA片段，编码区以ATG启动子开始紧接着一个内含子，其中编码区含有3个内含子。以pET-28a(+)为原核表达载体，大肠杆菌BL21(DE3)为宿主表达菌，在37℃，IPTG终浓度1mmol/L，诱导时间8h，转速150r/min条件下，实现最优表达;并通过SDS-PAGE凝胶电泳及Western Blotting检测分析表明蛋白表达正确。以pCAMBIA2300-35S-OCS为载体，构建pCAMBIA2300-ZnBP超表达载体，并用冻融法转化GV3101感受态农杆菌。农杆菌侵染法将ZnBP基因转入野生型拟南芥（哥伦比亚型），待成熟收取种子。通过含有Kana抗生素培养基的筛选以及PCR验证，获得两株转基因拟南芥。Northern Blotting检测分析表明转基因拟南芥中ZnBP基因的表达水平高于野生型拟南芥，并且在表型上转基因拟南芥也矮于野生型拟南芥。其中的表型差异可以推论ZnBP基因抑制拟南芥的生长。实验还将继续研究ZnBP在棉花腺体形成以及在棉花生长过程中的作用，以进一步了解该基因的生物学功能。
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