红细胞膜包覆上转换纳米粒的制备及其靶向乳腺癌多模态显像的研究

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目的:迄今为止,上转换纳米颗粒(Upconversion nanoparticles, UCNPs)已广泛应用于肿瘤成像、药物靶向研究和许多其他生物医学领域。然而,较短的血液清除时间和纳米颗粒的免疫原性限制了它们在体内的进一步应用。作为一种更加安全,更具生物相容性的载体,天然细胞膜已成为当前的研究热点。通过将细胞膜覆盖于纳米颗粒表面,可使得纳米颗粒继承源细胞复杂而独特的表面物理和化学性质。在这项研究中,叶酸(Folic acid,FA)插入的红细胞膜包覆的上转换纳米颗粒被设计用来增强纳米粒子的生物相容性和肿瘤靶向能力,从而实现4T1乳腺癌的靶向多模态成像。
  方法:经低渗溶血法及机械挤压制备红细胞膜囊泡(RBC-vesicles)。1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[叶酸(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG-FA)与其共孵育形成FA修饰的红细胞膜囊泡(记为FA-RBC-vesicles)。通过机械挤压将RBC-vesicles及FA-RBC-vesicles分别包覆于UCNPs表面以制备红细胞膜包覆的上转换纳米颗粒(RBC-UCNPs)及叶酸修饰的红细胞膜包覆的上转换纳米颗粒(FA-RBC-UCNPs)。动态光散射用于测量UCNPs、RBC-UCNPs和FA-RBC-UCNPs的物理特性和光学性质。透射电子显微镜(Transmission electron microscopy,TEM)及紫外分光光度计(UV-vis spectrometry,UV)鉴定RBC-UCNPs的核-壳结构。SDS-PAGE验证红细胞膜包覆前后的蛋白表达。CCK8试剂盒检测UCNPs、RBC-UCNPs和FA-RBC-UCNPs的细胞毒性。UCNPs,RBC-UCNPs和FA-RBC-UCNPs经尾静脉注射至4T1荷瘤小鼠体内,并于注射后不同时间点进行磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)及上转换发光(Upconversion luminescence,UCL)成像。1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[叠氮基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG-N3)与DSPE-PEG-FA及RBC-vesicles共孵育后包覆于纳米颗粒表面,制备叶酸-叠氮基共修饰的红细胞膜包覆的上转换纳米颗粒(N3 (FA )-RBC-UCNPs )及叠氮基修饰的红细胞膜包覆的上转换纳米颗粒(N3-RBC-UCNPs)。将N3(FA)-RBC-UCNPs和N3-RBC-UCNPs提前36小时注射到4T1荷瘤小鼠体内。体外标记合成Al18F-NETA-L-DBCO,随后将此放射性示踪剂经尾静脉注射至小鼠体内进行点击化学反应。注射Al18F-NETA-L-DBCO后0.5小时、1小时及2小时行小动物PET静态显像及生物分布研究。正常小鼠注射纳米粒样品后,进行为期30天的系统毒性评估。
  结果:红细胞膜包覆前后,UCNPs及RBC-UCNPs的粒径分别为115.6nm和138.9nm,zeta电位由UCNPs的-17.2mV变为RBC-UCNPs的-12.1mV。TEM图像显示RBC-UCNPs具有特征性的核-壳结构。UV显示,与UCNPs相比,RBC-UCNPs在400nm附近呈现出额外的红细胞膜特征性吸收峰。SDS-PAGE显示,制样过程中RBC-vesicles的膜蛋白未发生明显丢失,RBC-UCNPs的主要蛋白条带基本和来源红细胞一致。UCL发射光谱表明,经RBC-vesicles包覆后,UCNPs的上转换荧光性能未见明显改变。CCK-8检测显示UCNPs,RBC-UCNPs或FA-RBC-UCNPs对4T1乳腺癌细胞无明显的细胞毒性。MRI和UCL成像表明,FA-RBC-UCNPs组在4T1荷瘤小鼠中肿瘤摄取最高。与UCNPs和RBC-UCNPs相比,FA-RBC-UCNPs中观察到的肝脏和脾脏的荧光信号相对较低。PET成像结果表明,N3(FA)-RBC-UCNPs组在不同时间点肿瘤部位的示踪剂摄取均高于N3-RBC-UCNPs组,此外,两组均在30分钟时的肿瘤摄取最高。然而,仅注射放射性示踪剂Al18F-NETA-L-DBCO而没有行预定位的对照组于整个成像过程中均未在肿瘤部位观察到明显的显像剂摄取。在所有三个组中,肝脏和脾脏均不可见,但部分肠道中的示踪剂较为浓聚。生物分布结果显示两实验组的肿瘤/肌肉比值均随时间延长而增加,且不同时间点N3(FA)-RBC-UCNPs的肿瘤肌肉比值均高于N3-RBC-UCNPs组,在0.5小时、1小时和2小时的比值分别为2.72±1.26、2.99±0.75、4.12±1.86%ID/g和2.29±0.39、2.98±1.26、3.08±0.48%ID/g。在体毒性研究显示,在注射不同纳米材料后30天内,各组小鼠的体重变化和死亡率均无显著差异。血液生化检测、血液学检测和组织学分析都表明RBC-UCNPs在体内具有良好的生物相容性,未引起明显的生物损伤。
  结论:本研究成功地联合仿生医学和纳米材料制备了RBC-UCNPs多功能分子探针,且该纳米材料具有良好的血清稳定性及生物相容性;插入DSPE-PEG-FA提升了纳米粒的靶向性,通过预定位策略及点击化学方法相结合成功地进行了短半衰期核素(18F)标记的仿生纳米材料的肿瘤PET显像,并成功构建了集上转换发光显像、磁共振显像、核素显像于一体的多模态显像仿生纳米平台。毒性研究表明,RBC-UCNPs不会产生明显的细胞毒性或全身毒性,在体应用安全可靠。综上,本研究制备的仿生纳米平台可以安全有效地用于肿瘤多模态显像,并可以进一步拓展在其他生物医学领域中的应用,以期在未来疾病的成像和治疗中发挥重要作用。
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