背景:类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性且具有对称性的自身免疫性疾病,当前其病理生理机制未明,影响着全球约1%-2%的人。RA患者若不给予治疗,轻则会造成残疾,引起全身性并发症,重则会导致早期死亡,造成社会经济损失。随着人们对RA越来越多的关注,RA研究已成为风湿病学领域中的一个重要课题。目前临床上治疗RA的药物治疗效果有限,且一些药物副作用大、价格昂贵,因此对于RA的治疗仍需开发新的药物。PDE5抑制剂通过抑制磷酸二酯酶5(PDE5)的活性,使体内c GMP的水平升高,从而激活PKG,进一步抑制Wnt/b-catenin信号通路转录活性和基因产物。本课题中PDE5抑制剂(PDE5i)是由中山大学药学院教授在已上市的PDE5抑制剂的基础上设计合成出的一种化合物。通过前期的探索实验,与其他磷酸二酯酶抑制剂相比,PDE5i具有更好的抗炎和抗增殖作用。同时,在前期实验观察到,PDE5i对RA大鼠的治疗具有明显的改善作用,PDE5i有望成为治疗类风湿关节炎的候选药物之一。目的:本研究将含BCG的弗氏佐剂注射至大鼠足跖部位建立类风湿关节炎模型,并使用PDE5i对造模成功的大鼠进行药物干预治疗28天。通过步态行为分析系统(Gait Analysis Lab)、Von Frey纤维丝测痛仪、影像学、病理组织学、免疫学评价以及酶联免疫吸附法(ELISA)等方法,评估PDE5i对RA的药效作用。再培养RA-成纤维样滑膜细胞(MH7A),基于蛋白质印迹法(western blot)考察PDE5i干预后细胞内相关蛋白的表达情况,探究PDE5i治疗RA的作用机制。方法:本实验分为三大部分:(1)将大鼠随机分为正常组(生理盐水i.p.)、RA组(生理盐水i.p.)、PDE5i高剂量组(3 mg/kg/d i.p.)、PDE5i低剂量组(1 mg/kg/d i.p.)、甲氨喋呤(MTX)组(1 mg/kg/d i.p.),每组12只。除正常组外,在每只鼠的左后足跖部位皮下注射新鲜配置的BCG佐剂(浓度10 mg/m L)建立RA模型,造模成功后给予相应药物28天。(2)给药治疗结束后,通过步态分析系统、Von Frey纤维丝测痛仪来评估各组大鼠行为学变化。采用影像学、HE染色、番红固绿染色以及免疫学评价等方法观察比较各组大鼠关节和免疫器官的病理变化。利用ELISA法检测大鼠血清中c GMP的含量变化,证明PDE5i的靶向性。同时使用ELISA法检测大鼠血清中炎症细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的含量变化,说明PDE5i对炎症的反应情况,进一步评估PDE5i对RA的药效作用。(3)选择MH7A细胞作为PDE5i作用机制的研究对象,设置RA组、PDE5i高、中、低给药组(浓度分别为32 n M、16 n M、8 n M)。基于WB检测各组细胞内的PKG、b-catenin、Cyclin D1和DKK-1蛋白表达情况,予以探讨PDE5i在RA中可能介导的信号通路。结果:(1)与正常组相比,RA组大鼠步态行为的各项步态指标都明显下降,且存在统计学差异(p<0.05),提示RA会导致大鼠出现行走障碍。同时,RA组大鼠的疼痛阈值与正常组相比明显降低,且存在显著的统计学差异(p<0.01)。PDE5i给药组与RA组大鼠相比,大鼠的行走障碍和疼痛阈值得到有效改善,且存在统计学差异(p<0.05)。(2)影像学、HE染色和番红固绿染色结果显示,RA组大鼠的骨关节受到明显的侵蚀破坏,关节腔出现大量炎性细胞浸润,滑膜增生,软骨组织出现大量纤维化。PDE5i给药组大鼠的骨关节对上述描述的情况均有改善作用。ELISA法检测RA大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α含量,与正常组相比均上升,差异具有统计学意义(p<0.05)。PDE5i给药组IL-1β、IL-6和TNF-α含量下降,与RA组相比存在统计学意义(p<0.05)。免疫学评价结果显示RA组与正常组大鼠相比,脏器指数明显升高,差异具有统计学意义(p<0.05)。PDE5i给药组大鼠脏器指数降低,与RA组相比,差异具有统计学意义(p<0.05)。(3)WB实验结果表明,PDE5i给药组与RA组相比,细胞内PKG蛋白表达水平呈浓度依赖性升高,且存在统计学差异(p<0.05);与RA组相比,PDE5i给药组细胞内的β-catenin、Cyclin D1和DKK-1蛋白表达水平呈浓度依赖性降低,且存在统计学差异(p<0.05)。结论:(1)PDE5i可有效改善类风湿关节炎引起的行走障碍和疼痛。(2)PDE5i可有效缓解骨关节侵蚀、滑膜炎症等病理情况,并通过介导Wnt/β-catenin信号通路有效调控RA相关功能,进而改善和治疗RA。