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[目的]目前常用的冻存保护剂中通常含有DMSO、胎牛血清、细胞培养基等成分,高浓度DMSO对细胞和人体都有毒副作用,胎牛血清和细胞培养基都不能直接输注到人体。本实验的目的是降低DMSO浓度,以降低输注人体后的毒副作用;采用临床可用成分(人血白蛋白、勃脉力A)来代替临床不可用成分(胎牛血清和细胞培养基),从而探索研究一种输注后毒副反应更低、更接近临床应用要求的细胞冻存保护剂。[方法]1、脐带血有核细胞的分离:采集50份健康正常分娩的足月新生儿脐带血,随机分为5组,使用羟乙基淀粉沉淀法分离得到脐带血有核细胞,加入不同浓度组合的冻存保护剂,A组:10%DMSO+5%人血白蛋白+勃脉力A; B组:7.5%DMSO+5%人血白蛋白+勃脉力A; C组:7.5%DMSO+10%人血白蛋白+勃脉力A; D组:5%DMSO+5%人血白蛋白+勃脉力A; E组:5%DMSO+10%人血白蛋白+勃脉力A。2、脐带血有核细胞的冻存:将上述脐带血有核细胞放入液氮罐中冻存6个月。分别于细胞冻存前、后采用全血自动分析仪计数脐带血有核细胞数量;通过台盼蓝染色法来检测细胞的活性;使用流式细胞仪检测CD34+细胞比例;采用甲基纤维素半固体培养体系培养细胞集落,培养14— 16天后在倒置显微镜下计数细胞集落数量,比较各组间上述指标,评估其冻存保护效果。3、对冻存保护剂进行安全性评估:使用勃脉力A配制含10%DMSO、7.5%DMSO和5%DMSO三种浓度的冻存保护剂。(1)急性毒性试验:选取24只ICR小鼠,随机分为4组,实验组小鼠分别经尾静脉注射0.2ml相应浓度的冻存保护剂,阴性对照组经尾静脉注射0.2ml生理盐水,观察注射后所产生的急性毒性反应情况,观察死亡情况,通过旷场实验检测小鼠行为活动等。(2)慢性毒性试验:选取24只Balb/C小鼠,随机分为4组,实验组小鼠分别经尾静脉注射0.2ml相应浓度的冻存保护剂,阴性对照组经尾静脉注射0.2ml生理盐水,每周注射一次,共4次。观察靶器官毒性反应或死亡情况,测量体重变化,通过旷场实验检测小鼠行为活动,称量饮食、饮水量,分析血生化指标(谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶、总胆红素、肌酐、尿素氮)以评估小鼠的肝、肾功能,取小鼠肝、肾组织进行石蜡切片、HE染色,评估小鼠肝脏和肾脏是否损伤。(3)过敏反应:选取30只豚鼠,随机分为5组,实验组注射相应浓度的冻存保护剂,阴性对照组注射生理盐水,阳性对照组注射人血白蛋白,观察各组豚鼠反复接受不同浓度的冻存保护剂后是否出现速发型全身过敏反应,如:竖毛、抓鼻、呼吸困难、抽搐和死亡等症状。[结果]1、脐带血有核细胞冻存复苏后各项检测指标:(1)有核细胞回收率A组和C组明显高于B组、D组、E组(P < 0.05),A组与C组差异无统计学意义(P> 0.05)。(2)台盼蓝拒染率A组和C组明显高于B组、D组、E组(P < 0.05),A组与C组差异无统计学意义(P>0.05)。(3) CD34+细胞回收率A组和C组明显高于B组、D组、E组(P< 0.05),A组与C组差异无统计学意义(P> 0.05)。(4)集落形成单位回收率A组和C组明显高于B组、D组、E组(P<0.05), A组与C组差异无统计学意义(P> 0.05)。A组和C组冻存保护剂在上述各项指标中均显示出较优的冻存保护效果。2、对冻存保护剂进行安全性评估:(1)急性毒性反应:各组小鼠均未出现死亡情况,与同期阴性对照组相比较,实验组小鼠未出现明显异常。(2)慢性毒性试验:实验观察期间,各组小鼠体重变化、行为活动、饮食饮水量与同期阴性对照组相比,差异无统计学意义。注射含10%DMSO冻存保护剂组小鼠在第2次注射后次日出现ALT (谷丙转氨酶)升高,与同期阴性对照组相比,差异有统计学意义;在第4次输注后次日,,ALT和AST (谷草转氨酶)均升高,与同期阴性对照组相比,差异有统计学意义。两周恢复期结束后,ALT和AST恢复正常,与同期阴性对照组相比,差异无统计学意义。肝脏和肾脏HE染色发现,输注10%DMSO冻存保护剂组有一只小鼠肝脏可见肝细胞弥漫性水肿。其余小鼠肝脏和肾脏HE染色未见明显异常。(3)过敏反应:致敏期间,所有小鼠均未出现明显的异常情况。经静脉注射激发后,阴性对照组小鼠未出现过敏症状,其过敏反应呈阴性;阳性对照组小鼠出现喷嚏、搔鼻、竖毛、痉挛、死亡等不同程度的过敏症状,其过敏反应呈阳性或极强阳性;实验组小鼠在整个实验期间未出现过敏反应症状,其过敏反应呈阴性。综上所述,A组冻存保护剂的肝脏毒性高于其它组。[结论]1、在体外细胞冻存实验中,冻存保护剂:7.5%DMSO+10%人血白蛋白+勃脉力A能达到与冻存保护剂:10%DMSO+5%人血白蛋白+勃脉力A等效的冻存保护效果。2、在小鼠体内急性毒性实验中,输注不同浓度组合的冻存保护剂后均不会出现急性毒性反应。3、在小鼠体内慢性毒性实验中,输注冻存保护剂:10%DMSO+勃脉力A有导致肝脏转氨酶升高的肝脏毒性。4、在小鼠体内过敏实验中,输注不同浓度组合的冻存保护剂后均不会出现过敏反应。5、综合冻存保护效果与安全性因素考虑,冻存保护剂:7.5%DMSO+10%人血白蛋白+勃脉力A是一种输注后毒副反应更低、更接近临床应用要求的细胞冻存保护剂。