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研究背景皮肤衰老是机体衰老的重要外在表现。皮肤衰老不仅有损于美容,也可导致许多年龄相关性疾病,而给人带来身心损害。由于皮肤真皮包含多种类型的细胞及纵横交错的细胞外基质成分,因而在皮肤衰老过程中发挥着主导作用。目前有关真皮衰老的机制研究涉及了表观遗传学、基因组学、蛋白组学等多种分子生物学层面,然而nicroRNA (miRNA)与真皮衰老之间的关系尚不明确。miRNA是一类短链单链RNA,通过与靶基因3’端的非编码区序列特异性相结合从而发挥负性调节作用。miRNA可在多个层面影响机体的生理病理过程。了解真皮衰老相关miRNA的表达特点及调控网络有助于进一步加深对真皮衰老的认识,为后续抗衰老研究提供新的思路。研究目的1.初步了解真皮衰老进程中的miRNA差异表达谱,探讨该差异表达谱对应靶基因可能涉及的基因功能和调控通路,建立miRNA与部分衰老相关靶基因之间的网络关系。2.探索该差异表达的miRNA在年轻和衰老成纤维细胞中的变化情况,比较其与组织结果之间的一致性和差异性,并探讨这些miRNA可能参与的细胞衰老调控通路。研究方法在第一部分中,本研究选取12例源于非曝光部位的真皮样本,包括6例年轻真皮组织和6例衰老真皮组织,利用miRNA芯片初步筛选出衰老和年轻真皮差异表达的miRNA,运用实时定量RT-PCR验证部分miRNA表达情况。继而利用niRNA对应靶基因进行功能聚类分析和信号通路聚类分析,构建miRNA与可能涉及衰老调控的靶基因之间的调控网络,并得到网络中起核心调控作用的miRNA。在第二部分中,本研究将原代真皮成纤维细胞分别培养于正常营养和低营养培养基中并进行连续细胞传代,对各自营养状态下传代早期细胞与传代后期细胞进行多种衰老标记的比较,包括利用细胞计数法比较了细胞增殖曲线,利用SA-β-GA染色法比较了衰老细胞比例,运用实时定量RT-PCR方法比较了衰老相关标记基因的mRNA表达量。最后通过实时定量RT-PCR方法比较了部分真皮衰老相关miRNA在衰老代和年轻代成纤维细胞之间的变化情况。研究结果1. miRNA芯片结果分析显示,随着皮肤真皮衰老,真皮组织中共有40个miRNA差异性表达。2.实时定量RT-PCR显示衰老组织内miR-34家族及miR-29家族表达显著增加,与芯片结果具有一致性。3.靶基因功能聚类和通路聚类分析发现,miRNA对应靶基因的主要功能聚类包括细胞间粘附作用、胶原合成作用、基因转录的正性及负性调控作用等,主要通路聚类包括代谢调节通路、生长因子通路和细胞外基质与受体调控通路、DNA损伤反应通路等。4. miRNA-Gene-Network分析显示miR-34家族、miR-29家族和miR-424在调控网络中占有较大权重5.无论在正常营养培养条件抑或低营养培养条件下,相较于早期传代细胞而言,传代至后期时细胞的增殖能力均明显下降,SA-β-GA阳性细胞比例显著上升,p16基因的mRNA表达水平显著上调,而p53及p21基因的mRNA水平未见明显变化。6. miRNA实时定量结果显示,无论何种营养培养条件下,筛选出的11个miRNA(即miR-548q、miR-1226*、miR-601、miR-1207-5p、miR-134、miR-34b*、 miR-34a、miR-29c*、miR-181a, miR-154、miR-424)在衰老代细胞中均呈现出上调表达的趋势,其中绝大多数变化趋势与组织miRNA芯片结果相一致,但miR-181a、miR-154和miR-424在衰老细胞内的变化趋势与芯片结果之间存在矛盾。7. miRNA上调变化程度在各自营养培养条件下传代的衰老细胞中有所不同,正常营养条件下衰老代细胞以miR-34家族和miR-29家族上调最为显著,而低营养培养条件下衰老代细胞以miR-1226*、miR-601及miR-1207-5p上调为剧,miR-29家族未见明显上调。8.实时定量RT-PCR结果发现,低营养培养条件下的衰老代细胞内,miRNA部分靶基因如E2F3、c-Myc、CREB在mRNA水平上尚存在表达下降。研究结论真皮衰老进程中存在miRNA的差异性表达,差异表达miRNA的靶基因主要参与细胞粘附、胶原合成、基因转录调控中,主要涉及代谢通路、生长因子通路、细胞外基质与受体相互作用及DNA损伤反应通路等,且miR-34家族、miR-29家族及miR-424可能在真皮衰老过程中有较为重要的调控作用。在体外成纤维细胞的衰老模型中可观察到与真皮衰老进程大致相似的niRNA变化情况,但个别miRNA显示出的矛盾结果提示miRNA可能参与到除成纤维细胞衰老以外的真皮衰老的机制中,如炎症反应、血管新生异常等。成纤维细胞所处营养环境差异对调控衰老的miRNA表达情况存在影响。另外,本次研究建立的细胞衰老模型中,真皮衰老相关miRNA可能主要通过与p16通路发生联系从而对成纤维细胞衰老进程进行调控。