叶绿体是高等植物和某些藻类进行光合作用的重要场所。叶绿体中95％以上的蛋白都是由核基因编码，在胞质中合成后，再转运至相应部位的。指导这些蛋白正确靶向定位的大多是其N端信号序列，也称导肽或信号肽(transitpeptide，tp)。但是目前叶绿体蛋白转运机理的研究结果非常少而且还存在一些分歧。因此，加强对叶绿体蛋白跨膜定位机理的研究具有十分重要的意义。磷酸丙糖/磷酸转运器(TPT)由位于叶绿体内被膜的匀质二聚化蛋白组成，是一个高效率的运输蛋白，也是光合同化物源库分配的重要调控位点。至今关于preTPT(TPT新生肽)定位的分子机制研究非常少。 本文主要利用基因缺失、替换和定点突变以及酵母双杂交等方法研究了拟南芥preTPT中指导其正确靶向定位的关键性元件以及与之识别结合的膜转运复合体组分，这对于阐明preTPT正确靶向叶绿体的定位机理，提高preTPT的运送效率等具有重要的理论意义。并且为作物的遗传改良和提高产量提供有力的实验证据。 利用RT-PCR的方法扩增了拟南芥preTPT全长cDNA。软件分析结果表明，该基因全长1233bp，编码410个氨基酸；tp长度为83个氨基酸；tp的N端部分带有正电荷，并且有一个14-3-3蛋白的结合位点；该蛋白还有8个跨膜结构域。为研究preTPT的定位机理，还扩增了拟南芥叶绿体被膜蛋白ceQORH(醌类氧化还原酶)和线粒体被膜蛋白Tom20的cDNA片段。并构建了preTPT-GFP，ceQORH-GFP的瞬时表达载体，并且在拟南芥叶片原生质体中获得清晰表达，在亚细胞水平上证明preTPT定位于叶绿体被膜。至此，我们建立了优良的瞬时表达体系，为进一步研究preTPT的跨膜定位机理奠定了基础。 通过基因序列的缺失、替换和定点突变等方法分析preTPT中指导其跨膜定位的关键性元件。3’端缺失、替换分析结果表明完整的tp只能将融合蛋白靶向定位到叶绿体内部，而不能指导其定位于被膜，要达到被膜定位还必须带有preTPT的第一个跨膜结构域，并且不可以用其它的跨膜结构代替，表明第一跨膜结构域与叶绿体内被膜有特异的识别和整合。对于不完整的tp(只含有preTPTN端60个氨基酸)，如在瞬时表达载体D5中，融合蛋白定位异常，星星点点的分布于叶绿体内和胞质内，这可能是由于tp缺失太多，破坏了融合蛋白与被膜转运复合体组分的作用位点，削弱了跨膜运送进程。 进一步对preTPT5’端的缺失、定点突变分析结果表明，preTPTN端的第2到第4个氨基酸区段对其叶绿体被膜定位不起主要作用；包含第五个氨基酸及其后一段氨基酸序列的结构域与与新生肽转运的起始相关，因为这一结构域的缺失将导致融合蛋白停留在胞质。另外，电荷作用力和14-3-3蛋白对preTPT跨膜转运的起始可能不起主要作用，因为将tpN端从正电状态改变为中性状态或破坏14-3-3蛋白的结合位点均不影响其被膜定位。 酵母双杂交分析表明，preTPTtp与拟南芥叶绿体被膜上的受体蛋白AtToc33和AtToc34均能发生相互作用。目前没有实验证明其它叶绿体内被膜蛋白利用TOC途径跨膜定位，因此preTPT可能代表一类新的利用TOC途径定位的叶绿体内被膜蛋白。 上述结果勾画出拟南芥叶绿体内被膜蛋白preTPT的定位途径，大致如下：首先新生肽最靠近N端的一个结构域与胞质某些辅助因子(14-3-3蛋白可能不起主要作用)以特定的方式(可能不是电荷作用)识别和结合，共同转运到叶绿体被膜外侧；然后与外被膜上的受体AtToc33和/或AtToc34识别结合，发生相互作用(可能还有其它TOC组分的参与)起始跨膜进程；最后在第一个跨膜结构域(或第一，二跨膜结构域成对)和某些因子的辅助下起始被膜整合进程。上述过程中，各种蛋白质之间的互作可能包括有能量ATP的消耗和蛋白质磷酸化/去磷酸化作用，这有待进一步的验证。