以玉米秸秆为代表的木质纤维原料被认为是“被忽视的资源”,作为重要的生物质能源,却以不科学的方式处理,造成了环境和经济的双重损失。通过酿酒酵母等微生物的发酵可以利用秸秆中的碳水化合物生成乙醇,而乙醇燃料因为其环保,可再生的优点被视为液体燃料最理想的替代品,具有很广阔的发展前景。但在秸秆糖化的过程中,需要进行一定的预处理以破坏纤维素的结晶结构和木质素的保护屏障,但这些预处理过程会产生一系列影响细胞生长和乙醇产量的抑制物。因此,本实验选取前期筛选得到的一株高耐受乙酸、糠醛等水解液中主要抑制物的菌株YB-A-6-1为研究对象,采用转录组测序技术和荧光显微镜技术研究酿酒酵母在玉米秸秆水解中的早期转录应答及亚细胞结构,共得到以下实验结果:1.玉米秸秆水解液会延长酿酒酵母的迟滞期,迟滞期的长短与接种量成负相关关系,以100%的接种量接入水解液培养基中,6 h以前细胞均处于迟滞期;而对3 h,6 h的细胞进行转录组分析,发现3 h的细胞正处于应激应答阶段,与对照相比,差异基因显著富集于抗氧化反应;6 h时细胞已经开始合成大分子,如受体蛋白等,为后期生长做准备。2.通过对3 h样品转录组数据中的差异表达基因进行分析,发现上调基因TRX3和TSA2能够编码硫氧还蛋白,及时有效清除产生于线粒体的活性氧,而且过氧化物酶基因GPX1,SYM1,CTT1也都上调表达,它们能清除细胞质中的活性氧,还有ASK10和RCK1也都大量上调表达,它们都是HOG-MAPK信号转导途径中基因,能够调控YAP2的转录,参与氧化应激;通过荧光显微镜观察各时间点细胞的活性氧信号,3 h时,细胞中积累了大量的活性氧,而6 h时,活性氧阳性信号细胞比例显著降低,这证明了玉米秸秆水解液会导致细胞产生大量的活性氧,但上调过氧化物酶基因,谷/硫氧还蛋白编码基因,能有效清除活性氧,并激活氧化应答机制,减小活性氧的损伤。3.对转录组测序得到的3 h的差异表达基因进行功能分类,发现17个上调基因富集于蛋白质的折叠与稳定,其中主要是Hsp70p家族的SSA1,SSA2,SSA3,SSE2及ECM10,它们能够与新翻译的蛋白质结合帮助其正确折叠并防止其发生聚集或错误折叠,但它们也参与分解错误折叠蛋白质聚集物的分解,而与促进其ATPase活性的Hsp40p家族的APJ1与SIS1也都上调表达;此外,特异性修复一些重要的转录因子及蛋白受体的HSP82和维持染色体轴蛋白结构的PCH2也都上调表达,而且这些基因启动子上游大多都含有压力应急响应元件,被Msn2p/Msn4p调控,本研究中MSN2和MSN4分别上调1.2和3.0倍,受蛋白激酶负调控的SFL1基因也上调表达,这暗示了c AMP-PKA信号转导途径的抑制可能导致细胞激活蛋白质保护应答机制;由于未折叠的蛋白质或错误折叠的蛋白质的过量积累会造成内质网的压力,进而破坏内质网的结构,通过荧光显微镜对不同时间点的细胞内质网膜结构进行观察,3 h时,内质网有轻微的破坏,但6 h时已经被缓解,这是细胞内部对新生蛋白质的保护与正确折叠,对错误蛋白的复性与清除的作用,减轻了内质网的压力,进而维持了内质网结构和功能的稳定性。4.在功能分类和基因注释过程中,还发现很多解毒相关基因的上调,如醛还原酶基因YDR541C,GRE2,ADH6,GOR1,GRE3,GOR1,GRE2以及酮还原酶基因DAK1,DAK2和YDL124W,它们能够还原不同的醛类化合物和酮为无毒或毒性较低的醇类化合物;调节细胞膜上的H+ATPase的基因HSP30,PMP2,PMP1也上调表达,它们能将细胞内的H+泵出维持细胞内部中性环境,通过以上基因的上调表达,降低有毒抑制物的毒害作用;并发现了三个可能的醛还原酶基因NRE1,BDH1,BDH2。5.对三个可能的醛还原酶基因进行克隆表达和相关酶活性检测发现,它们均具有醛还原酶活性,它们都表现为更偏好NADH作为辅酶,NRE1至少对三种醛类化合物还原酶酶活性,包括乙醛、环戊酮和2-戊酮,BDH1在NADH作为辅酶的条件下,对6种底物表现出活性,乙醛作为底物时活性高达79 U/mg,BDH2至少能还原7种底物,对乙醛的酶活力最高,为92 U/mg。本研究初步探明,酿酒酵母通过清除各细胞部位的活性氧、保护和正确新生蛋白质、复性错误折叠蛋白和清除畸变蛋白以维持内质网的结构、还原脱毒醛、酮类化合物并激活质子泵维持细胞中性环境等机制实现了细胞对玉米秸秆水解液中抑制物的耐受作用,为高耐受秸秆水解液的酿酒酵母工程菌株的构建提供了参考。