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背景:刚地弓形虫（Toxoplasma gondii,Tg）是一种机会致病性的专性有核细胞内寄生原虫,猫科动物为终宿主,且在全球广泛传播,可以感染几乎所有温血动物。弓形虫感染宿主引起的弓形虫病有不同的临床表现,主要由弓形虫虫株毒力及宿主差异所决定,严重危害人类健康和畜牧业生产。而弓形虫先天性垂直传播仍然是当前导致不良妊娠的重要因素之一,弓形虫可以通过胎盘感染胎儿,导致严重不良妊娠结局。虽然弓形虫感染引起的出生缺陷可能机制包括结构性损伤,内分泌失调,胎盘组织细胞凋亡增加等几个方面,但目前先天性弓形虫病的关键发病环节和确切机制仍不清楚。弓形虫在宿主细胞可引起双重的凋亡效应。一方面,弓形虫感染的细胞对凋亡刺激信号表现出相对的抵抗性;另一方面,已经发现弓形虫感染可诱导脾细胞、神经细胞、滋养层细胞等细胞的凋亡。研究已经证明,不同毒力弓形虫株感染的转归和结局与感染细胞的凋亡以及宿主的有效的免疫应答密切相关。因此,细胞凋亡的启动和凋亡的发展程度可能在弓形虫病的发病机制和最终转归中起着关键作用。弓形虫虫株毒力与不同基因型衍生的多态蛋白息息相关。目前来源于北美及欧洲弓形虫虫株主要分为三个基因型,即Type I、II和III型;而我国则以Chinese 1（Toxo DB#9）型为优势基因型。弓形虫侵入细胞释放的多态蛋白主要包括棒状体分泌的棒状体蛋白（ROPs）系列如ROP16、ROP18等,以及致密颗粒分泌的致密颗粒蛋白（GRAs）系列如GRA15、GRA3等。研究发现弓形虫I/III型的ROP16蛋白具有激酶活性,可以磷酸化STAT3、STAT6从而使Mφ激活为旁路活化的表型（AAMs,M2）,后者高表达IL-10和Arginase,低表达IL-12;II型弓形虫的GRA15蛋白可以不经过TLRs途径而直接磷酸化NF-κB p65蛋白,使Mφ激活为经典激活表型（CAMs,M1）,导致大量前炎性因子如IL-12、IL-23a、IL-6的释放,引起Th17、NK细胞的活化。内质网（ER）是细胞内蛋白质合成、折叠和组装的主要细胞器。未折叠或错误折叠蛋白的积累可导致内质网适应性反应,称为未折叠蛋白反应（UPR）,最终导致内质网应激（ERS）。越来越多的证据显示,在各种毒性物质、感染等刺激引起细胞凋亡的调控中,内质网应激起着关键的作用。滋养层细胞凋亡的改变可以导致流产和胎儿损伤。有研究表明,弓形虫ME49株感染绒毛膜滋养层Be Wo细胞较RH株感染表现出了更高的凋亡倾向。之所以导致两种虫株引起宿主细胞凋亡结局的差异,考虑可能与它们毒力因子的多态性有关。ME49作为II型虫株代表,携带GRA15II基因,所表达的GRA15分子具有激酶活性,GRA15是否参与了弓形虫诱导细胞凋亡的分子机制,是我们本课题需要回答的命题。目的:基于我国流行的优势基因型Chinese 1弓形虫强毒株Wh3株GRA15的基因特异性,研究其对绒毛膜滋养层细胞凋亡的调控作用,揭示弓形虫诱发细胞凋亡的途径,阐明弓形虫感染致不良妊娠的机制。方法:构建我国流行的基因型Chinese 1弓形虫Wh3株GRA15基因真核表达载体p EGFP-GRA15并转染人绒毛膜滋养层细胞JEG-3;利用MTS比色法检测细胞存活率;DAPI染色观察转染细胞的凋亡情况;流式细胞术分析转染细胞的凋亡率;荧光定量PCR法检测凋亡相关基因Caspase-3、Caspase-4、Caspase-8、Caspase-9、GRP78、CHOP、ATF4、ATF6和XBP1的表达水平;通过Western blot检测转染细胞凋亡相关蛋白Caspase-3、PARP-1、Bax、CHOP、GRP78、JNK、P-JNK、IRE1、P-IRE1、p38、P-p38、PERK和P-PERK的表达情况;在转染细胞中使用IRE1抑制剂4μ8C处理后,利用Western blot检测XBP1s、CHOP、TRAF2、ASK1、P-ASK1表达水平的变化;在转染细胞中分别使用4μ8C和JNK抑制剂SP600125处理后,同时利用MTS法检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blot检测细胞凋亡相关蛋白Caspase-3、JNK、P-JNK、Bax表达水平的变化。结果:成功构建我国流行的基因型Chinese 1弓形虫Wh3株GRA15基因真核表达载体p EGFP-GRA15,测序比对序列后证实,Wh3株GRA15与Type II PRU株的GRA15序列完全一致,故将Wh3株GRA15表示为GRA15II;成功在JEG-3细胞表达GRA15II分子;MTS法检测转染细胞存活率呈下降趋势;DAPI染色显示转染细胞发生凋亡现象;流式细胞术检测细胞凋亡率结果显示转染细胞凋亡率呈上升趋势;荧光定量PCR法检测凋亡相关基因转录水平结果显示,转染细胞中Caspase-3、Caspase-4、GRP78、CHOP、XBP1的转录水平呈上升趋势,Caspase-8、Caspase-9、ATF4、ATF6转录水平未见明显改变;Western blot检测转染细胞凋亡相关蛋白结果显示,转染细胞中的Cleaved caspase-3、Cleaved-PARP、Bax、CHOP、GRP78、P-JNK、P-IRE1的表达均上调,而p38、P-p38、PERK和P-PERK的表达未见明显变化。根据以上结果初步判断,GRA15II可触发JEG-3细胞凋亡,且凋亡过程可能与内质网应激相关。在p EGFP-GRA15II转染细胞中加入IRE1抑制剂4μ8C处理后,Western blot结果显示细胞XBP1s、CHOP、TRAF2和P-ASK1表达水平增加;转染细胞中分别使用4μ8C和JNK抑制剂SP600125处理后,MTS法结果显示,抑制剂处理组的细胞存活率较未处理组有所升高,抑制剂有效缓解GRA15II引起细胞死亡的作用;流式结果显示,抑制剂处理组的细胞凋亡率较未处理组有所降低,抑制剂有效缓解GRA15II对细胞的凋亡作用;Western blot结果显示,抑制剂处理组较未处理组在Cleaved caspase-3、P-JNK、Bax表达水平有下降趋势。结论:成功构建Chinese 1型弓形虫Wh3株致密颗粒GRA15真核表达载体p EGFP-GRA15质粒,测序比对序列后证实,Wh3株GRA15与Type II PRU株的GRA15序列完全一致;成功在人绒毛膜细胞JEG-3表达GRA15II分子;GRA15II可以诱导JEG-3细胞凋亡;GRA15II可以通过ERS信号通路的IRE1活化途径诱导JEG-3细胞凋亡。