热量限制保护卵巢功能的机制研究

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目的:寻找热量限制保护卵巢功能的适宜实验条件,并研究热量限制在卵巢功能保护中的作用,初步探讨其机制。  方法:  1、热量限制保护卵巢功能的模型构建与评价:取8周健康雌性C57BL/6小鼠30只,随机分为自由饮食(ad libitum,AL)、25%CR和45%CR三组进行模型构建,评价小鼠的一般情况和卵巢功能。通过对卵巢连续切片进行HE染色后光镜下卵泡计数和 Real-Time PCR技术检测小鼠卵巢抗苗勒氏管激素(Anti-Miillerian Hormone,AMH) mRNA的表达改变检测卵泡储备功能,Real-Time PCR技术检测小鼠卵巢FOXO3a和CYP11A的mRNA的表达改变评估卵巢的功能。  2、热量限制保护卵巢功能的机制研究:取8周健康雌性C57BL/6小鼠随机分为AL组、CR组和高脂饮食(high fat,HF)组,建立小鼠模型。苏木素-伊红(haematoxylin-eosin,HE)染色进行卵泡计数,Real-Time PCR技术检测小鼠卵巢AMH mRNA的表达改变;用TUNEL染色方法测定小鼠卵巢凋亡情况;用ELISA方法测定小鼠血清雌激素、孕激素的浓度,合笼后评价小鼠的产仔率和仔鼠存活率。Real-Time PCR技术检测小鼠卵巢中包括SIRT3(sirtuin3),FOXO3a,缺氧诱导因子1α(Hypoxia-inducible factor1α,HIF-1α)与过氧化氢酶(Catalase,CAT)。  结果:  1、热量限制保护卵巢功能的模型构建与评价:AL、25%CR和45%CR小鼠体重均呈现波动增长的趋势。25%CR和45%CR小鼠脑、心脏、肝脏、肾脏的重量与AL组相比有明显下降。卵泡计数结果显示25%CR组小鼠卵巢始基卵泡数明显高于AL组和45%CR组,小鼠卵巢AMH的mRNA的相对表达量与卵巢始基卵泡计数结果一致;AL组小鼠窦状卵泡数显著高于45%CR组;25%CR组和45%CR组始基卵泡的比例明显高于AL组始基卵泡的比例,AL组次级卵泡的比例高于45%CR组次级卵泡的比例,AL组窦状卵泡的比例高于25%CR组窦状卵泡的比例。检测各组小鼠卵巢内FOXO3a和CYP11A的mRNA相对表达量,可见与AL组小鼠相比25%CR组小鼠卵巢CYP11A表达明显上调,45%CR组小鼠卵巢FOXO3a表达明显上调。  2、热量限制保护卵巢功能的机制研究:与AL小鼠相比较,CR小鼠卵巢中的始基卵泡比例增加、闭锁卵泡比例下降,AMH表达水平显著上调;HF组卵泡比例与AMH表达水平与自由饮食组相似。热量限制组小鼠卵巢凋亡明显少于自由饮食组和高脂饮食组。检测小鼠血清激素分泌发现热量限制组小鼠雌激素浓度高于自由饮食组和高脂饮食组;自由饮食组小鼠孕激素浓度高于热量限制组和高脂饮食组。热量限制组小鼠四个月共产仔62只,存活27只,存活率为44%;自由饮食组小鼠四个月共产仔54只,存活21只,存活率为39%;而高脂饮食组小鼠四个月共产仔32只,存活10只,存活率为31%。与AL组小鼠相比较,CR组小鼠SIRT3、FOXO3a、CAT表达上调,HIF-1α表达下调;HF组SIRT3和HIF-1α下调。  结论:  1、8周健康雌性C57BL/6小鼠以25%CR进行为期8周的模型构建,可以在不影响生长发育的前提下达到保护卵巢功能的目的。  2、热量限制通过抑制卵泡募集和减少卵泡闭锁,从而减少卵泡消耗,提高卵泡质量,达到保护卵巢功能的目的。其作用机制可能与抗氧化应激有关。
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