兔出血症（RHD）是由兔出血症病毒（RHDV）引起兔的一种急性、烈性、高度传染性和高度死亡率的传染性疾病,其典型病变以呼吸系统出血、肝坏死、出血,实质性器官出血、水肿、淤血等为特征,成年家兔感染后死亡率高达90%～100%,给全世界养兔业带来了巨大的经济损失。RHDV为杯状病毒科兔病毒属成员,为单股正链RNA病毒,其基因组由7437个核苷酸组成,拥有两个开放阅读框架（ORF）,分别编码多个蛋白,其中衣壳蛋白VP60是RHDV的唯一结构蛋白,与诱导抗病毒感染的免疫反应直接相关。目前,预防兔出血症病的有效手段是疫苗接种,而使用的RHDV疫苗有兔出血症病毒灭活疫苗、兔病毒性出血症多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗、兔出血症病毒巴氏杆菌魏氏梭菌三联灭活疫苗等,这些疫苗具有良好的免疫效果,但也存在一些缺点,如生物安全问题、对幼兔免疫效果差等。本研究通过分子生物学技术构建重组兔出血症病毒VP60杆状病毒载体（BAC-VP60株）,感染悬浮培养的Sf9细胞,表达和纯化VP60蛋白,加入适宜佐剂,经灭活后制作基因工程亚单位灭活疫苗并初步应用,以解决灭活疫苗只能免疫成年家兔和生物安全等问题。1.含兔出血症病毒VP60杆状病毒载体制备与鉴定制备:用SF-SFM培养基（含10%胎牛血清）在细胞方瓶中对Sf9昆虫贴壁细胞进行培养,待细胞铺满细胞方瓶时,按细胞培养液总量的1%（MOI:0.5）接种,在27～28℃条件下培养,连续观察5日,当85%的细胞出现病变（肿大、变圆、破裂、折光性增强等）时收获,将细胞收获物置于2～8℃保存。鉴定:经测定该病毒液病毒含量(TCID50)≥108.0/m L;红细胞凝集价≧28;提取重组杆状病毒DNA,用扩增VP60基因的引物进行PCR扩增测序,基因序列符合衣壳蛋白VP60基因序列;经蛋白质电泳（PAGE-SDS）鉴定,VP60蛋白得到特异性表达,有大小约60 k Da的目的条带;经安全性、免疫原性检验均符合要求;按照现行《中国兽药典》附录进行检验,无细菌、霉菌、支原体和外源病毒污染,纯净性符合要求。2.兔出血症病毒杆状病毒载体灭活疫苗半成品制备与鉴定本研究应用7.5L、15L、60L生物反应器对Sf9昆虫细胞悬浮培养工艺进行了系统研究,优化了细胞初始培养浓度、生物反应器搅拌方式、搅拌速度、DO、培养基补给方式等关键技术参数。优化病毒接种剂量（MOI）、DO、培养温度参数等。Sf9昆虫细胞悬浮培养工艺:细胞初始生长浓度为8*105cells/m L,培养体积为罐体积的1/3,转速为60r/min,溶氧条件为45%,温度为27℃～28℃,培养基补给方式为灌注方式,经96h培养后细胞峰值达到8.0～8.5*106cells/m L;病毒培养工艺:细胞接毒初始浓度2.0*106cells/m L,接毒剂量为:0.5MOI,转速为60r/min,溶氧条件为30%,温度为27℃～28℃,一次性收获培养,接毒后经72h～96h培养,在显微镜下观察,细胞出现肿大、破裂,折光性增强,细胞内出现包涵体等细胞病变（CPE）,经测定病毒血凝效价（HA）可达28以上。将收获的细胞培养物使用10%甲醛溶液灭活,甲醛终浓度为0.2%。经纯净性检验,符合现行《中国兽药典》标准;同时经灭活检验不能致细胞病变和血凝性。3.兔出血症病毒杆状病毒载体灭活疫苗成品制备及检验将检验合格的半成品与氢氧化铝胶按照9:1的比例充分混匀震荡,定量分装,加塞密封,贴签。按照生物品检验规程对兔出血症病毒杆状病毒载体灭活疫苗成品的质量进行性状、装量、无菌、安全性、效力检验、甲醛残留量等指标的检测,各评价指标均满足要求。4.兔出血症病毒杆状病毒载体灭活疫苗的免疫效果根据以上研究,生产车间内共制备共计约630万头份疫苗,并对疫苗产品的安全性、免疫效力、免疫期、保存期等进行研究。结果表明所有批次疫苗对家兔均安全;疫苗具有较好的免疫效力,免疫期（免疫持续期）达6个月;产品置于2～8℃保存,至少为24个月。结论:本研究成功制得兔出血症病毒杆状病毒载体灭活疫苗,能对所有兔种产生良好的免疫应答,并保护试验兔对抗强毒的攻击,免疫效力达到90%以上。表明该悬浮生产工艺是合理、稳定、可应用的。同时也为后续的更大规模的生产奠定了坚实的基础,推进了兔出血症病毒杆状病毒载体灭活疫苗投入市场,并可逐渐代替原材料越来越困难的组织灭活疫苗,在预防兔出血症的基因工程疫苗的产业化方面具有应用和开发价值。