临床上骨折及骨不愈合等骨科常见疾病,其治疗始终是骨科领域研究的热点和难点问题,如疗效不佳则严重影响患者功能预后。近年来,创伤骨科如外固定架等治疗技术及组织工程骨研究的迅猛发展,均得益于对骨折再生与重建机制的深入研究探索。由此可见,对骨折再生和重建过程中多种因素的生物学效应及调控机制进行广泛深入的研究,将为临床治疗提供了全新治疗思路和技术方法。神经因素在骨组织再生及重建过程中作用重要,而神经肽正是神经因素发挥调节作用的主要物质。P物质(Substanc P, SP)是广泛分布于骨髓和骨膜的感觉神经元分泌的一种神经肽,其生物化学结构由11种氨基酸构成,参与调控骨组织细胞如骨髓基质干细胞、成骨细胞的生物学效应。SP已被证实参与了细胞炎症反应、增殖、成骨分化、凋亡和动员过程。骨再生及重建过程中神经肽SP阳性的神经纤维数量增加,提示SP可能直接参与局部的骨形成调控过程。不少体内和体外细胞学实验已经表明,SP可以通过促进骨髓基质干细胞(BMSCs)增殖能力增强、成骨基因表达及矿化来促进骨形成过程,调控骨折愈合生理过程。骨形成过程中骨髓基质干细胞需要一定的数量基础,而神经肽SP可能是维持大鼠骨髓基质干细胞数量基础的调控因子,即通过调控细胞增殖和凋亡来控制细胞数量。已有研究表明,SP可作用于人结肠癌细胞抑制细胞凋亡信号通路并可抑制辐射损伤的大鼠骨髓基质干细胞凋亡,初步显示了P物质的保护作用。然而,SP是否可作用于大鼠骨髓基质干细胞发挥调控去血清诱导凋亡的作用,目前尚未研究。因此,进一步探索研究神经肽P物质对骨髓基质干细胞去血清诱导凋亡的调控效应有助于理解神经肽在骨折愈合过程中的保护效应。神经肽SP的调控作用通常需要通过相关受体实现,SP受体主要是神经激肽-1受体(NK-1受体),此受体可介导SP促进骨形成的生物学效应过程。已有研究证实骨髓基质干细胞和成骨细胞MC3T3-E1细胞能够稳定表达NK-1受体的mRNA,且表达部位位于细胞的细胞质及细胞膜内,提示SP相关调控作用的可行性。NK-1受体可介导某些抗凋亡反应,如NK-1受体拮抗剂可诱导人类癌细胞株(Hep-2)凋亡。因此NKl-1受体表达及SP调控凋亡机制的相关性可能是神经肽P物质调控骨折愈合生理过程的关键环节。细胞生物学效应的调控离不开细胞信号通路。已有研究证实经典Wnt/β-catenin通路和MAPK信号通路等多种细胞信号通路参与了P物质调控BMSCs增殖和矿化,但Wnt信号通路是否参与SP抗骨髓基质干细胞去血清诱导凋亡尚未证实。经典Wnt/β-catenin信号通路是骨代谢生理的关键通路因素。经典Wnt通路可以概括为β-连环蛋白(β-catenin)在细胞质内表达增加,积累到一定程度时可进入核内引起下游Wnt相关基因如c-myc等转录表达。研究表明,SP调控骨髓基质干细胞增殖效应、促进BMSCs和前成骨细胞(MC3T3-E1)分化程度均与经典Wnt通路有关,而Wnt信号通路与细胞凋亡通路也具有相关性。因此SP的抗凋亡作用是否由经典Wnt信号通路介导有必要进行研究。以上研究背景提示目前存在三个问题,即：P物质是否能够调控骨髓基质干细胞的去血清诱导凋亡过程?其调控效应具有何种浓度及时间特点?其调控机制涉及何种凋亡信号通路及Wnt信号通路改变?这些问题的解释将进一步加深目前对神经因素通过神经肽调控骨折愈合过程的分子机制的研究,以及骨折修复过程中的神经保护作用的理解。本研究主要是研究神经肽P物质对大鼠BMSCs去血清诱导凋亡的调控效应、凋亡蛋白3等凋亡信号改变及相关经典Wnt/β-catenin通路机制,同时探讨NK-1受体表达水平在细胞凋亡过程中的变化情况。本实验主要的实验材料、方法、内容和结论主要包括以下几个部分：研究目的1.神经肽P物质对大鼠骨髓基质干细胞去血清凋亡的影响。2.神经肽P物质作用下去血清诱导凋亡的大鼠骨髓基质干细胞的凋亡通路相关信号改变情况。3.神经肽P物质调控骨髓基质干细胞凋亡与经典Wnt/β-catenin通路的关系。第1部分大鼠骨髓基质干细胞的获取鉴定及NK-1受体检测实验目的：通过全骨髓培养法获取纯度较高的大鼠BMSCs,并通过流式鉴定其纯度,同时研究其NK-1受体表达。实验方法：1.大鼠骨髓基质干细胞获取实验动物选择年龄一个月左右重量80-100g大小的SD大鼠,按照实验动物伦理学要求直接脱颈法处死,于清洁条件无菌器械辅助下,按层次切开大鼠解剖结构后获取大鼠的股骨及胫骨。使用针头冲洗骨髓腔,加入DMEM培养基(含10%胎牛血清)行全骨髓法分离培养BMSCs。2.大鼠骨髓基质干细胞培养原代培养大鼠骨髓基质干细胞48-72h后,首次换液后及时清洗培养瓶,去除未贴壁细胞后传代培养,按照1：2或1：3的接种比例经胰酶消化后传代至培养瓶中,采用含胎牛血清(10%)及青霉素链霉素溶液(1%)的DMEM培养基进行培养。培养瓶内液体每2-3天进行换液,细胞生长铺满瓶底后传三代,胰酶消化后按1：2传代,通过光镜及倒置显微镜观察大鼠BMSCs形态变化特点。3.大鼠骨髓基质干细胞鉴定取三代骨髓基质干细胞,PBS冲洗细胞计数后,消化细胞至流式细胞小采用流式鉴定法检测表面标记FL1-Height、CD90、IgG1、CD34、CD44、CD45、 IgG2a、CD11b/C.HAMSTER和CD29表达情况。通过检测CD34和CD45来排除造血干/祖细胞、血细胞、成纤维细胞的可能性,通过检测CD44.CD29来确定骨髓间充质干细胞的纯度。4.NK-1受体表达检测将细胞铺板于96孔板内,固定后使用一抗(抗NK-1受体抗体)孵育,之后用FITC二抗孵育,待充分染色后于荧光显微镜下观察。将细胞施加正常及去血清处理后,对NK-1受体进行western blot检测其蛋白量。实验结果：通过全骨髓培养法于体外成功分离培养出可用于实验的较高纯度大鼠BMSCs.流式细胞术鉴定结果显示FL1-Height(0.2%±1.7%).CD90(99.7% ±3.1%).IgG1(0.96%±1.3%).CD34(1.06%±1.3%)、CD44(99.8%±4.1%).CD45 (1.7%±2.1%).IgG2a(0.35%±2.9%).CDllb/C(0.6%±1.7%).HAMSTER(0.09% ±0.7%).CD29(99.88%±3.1%),符合骨髓基质干细胞的免疫表型特征。同时,NK-1受体表达于骨髓基质干细胞细胞膜及细胞质内,其蛋白表达量相对稳定。实验结论：全骨髓培养法可获得大量纯度较高的大鼠骨髓基质干细胞,且其表面稳定表达NK-1受体,为下一步研究提供了种子细胞和理论基础。第2部分P物质对骨髓间充质干细胞去血清诱导下细胞活性的影响实验目的：初步观察P物质作用于去血清诱导下的BMSCs后的细胞活性变化。实验方法：1.实验分组处理取三代骨髓基质干细胞,分为四组,即对照组(加入等量PBS做安慰剂)、SP(10-8 mol/L)组、SP (10-10mol/L)组、SP (10-12mol/L)组,接种于96孔板内于去学期诱导凋亡后12小时和24小时分别采用MTT法检测细胞活性。初步筛选出适宜浓度和适宜时间点后,使用DAPI荧光染色法和Annexin V-FITC/PI染色,荧光显微镜观察和上机(流式细胞仪)检测细胞凋亡率改变。2.MTT法检测细胞活性96孔板内每孔加入15μl的MTT溶液(1：10稀释),于37℃环境下孵育4h后,每孔加入150μl的DMSO用于溶解产生的晶体,随后利用酶标仪测定吸光度(495 nm波长读数)。3. DAPI荧光染色检测细胞核取第三代大鼠骨髓基质干细胞,适度调整细胞密度后,接种于96孔板内进行实验干预,24 h后添加50μl的DAPI染色液15分钟,之后弃去染色液于荧光显微镜下以紫外光激发、观察并拍照。4.流式细胞仪Annexin V-FITC/PI染色法测定凋亡率取第三代细胞进行实验干预后,DPBS清洗后以不含EDTA的胰酶消化收集细胞于流式小管内,分别加入Annexin V-FITC及PI试剂充分混和,同时设立阴性对照和阳性对照管,上机测定Annexin V-FITC及PI荧光信号。实验结果：MTT结果显示24h去血清处理后,10-10 mol/LSP实验处理能够提高细胞活性,进一步的DAPI荧光染色显示SP能够保护细胞核形态皱缩形变等改变,且减少细胞凋亡率(Annexin V荧光标记法)。实验结论：P物质能够提高骨髓基质干细胞于去血清处理后的细胞活性,改善细胞核形态变化且减少细胞凋亡率。第3部分P物质对骨髓间充质干细胞去血清诱导凋亡影响及相关凋亡通路调控机制的初步探讨实验目的：初步探讨P物质调控骨髓基质干细胞凋亡过程中的细胞凋亡通路信号改变。实验方法：1.实验分组处理首先将第三代大鼠骨髓基质干细胞随机分为四组,即对照组、SP(10-8 mol/L)组、SP(10-10 mol/L)组、SP (10-12 mol/L)组,测定凋亡蛋白3表达,探讨P物质抗凋亡效应的浓度特异性。进一步设置对照组、SP (10-10 mol/L)组、SP (10-10 mol/L)+NK-1受体拮抗剂(Spantide 10-8 mol/L)组,探讨SP抗凋亡效应机制。2.免疫荧光、Western blot、Q-PCR检测凋亡蛋白3 (caspase-3)表达取实验处理后的细胞,多聚甲醛固定后,使用1%的BSA封闭抗原30分钟,caspase-3一抗孵育过夜,二抗室温下孵育15分钟,荧光显微镜下观察拍照。提取实验组RNA和蛋白后,定量测定caspase-3 mRNA和蛋白表达。3. Q-PCR检测凋亡基因改变利用Rneasy试剂盒提取实验组RNA后,测定RNA浓度及纯度。利用合成的cDNA进行逆转录反应,荧光定量测定凋亡基因caspase-3、Bcl-2、Bax、 caspase-8、caspase-9含量,其结果同时根据GAPDH内参含量修正。实验结果：P物质作用于去血清的骨髓基质干细胞后,凋亡蛋白3荧光染色阳性细胞数量减少,相关RNA和蛋白表达减少,以10-10 mol/L最为明显。凋亡基因改变显示P物质在12小时和24小时可减少凋亡信号Bax/Bcl-2比例,调控caspase-8、 caspase-9和caspase-3凋亡基因改变。实验结论：P物质可调控骨髓基质干细胞的内源性凋亡通路信号,减少凋亡蛋白3表达,从而抑制细胞去血清凋亡过程。第4部分 P物质调控骨髓间充质干细胞去血清诱导凋亡的相关经典Wnt/p-catenin通路机制的探讨实验目的：初步探讨P物质调控骨髓基质干细胞凋亡的经典Wnt通路信号相关机制。实验方法：1.实验分组处理首先设置对照组、SP(10-10 mol/L)组、SP (10-10 mol/L)+Wnt通路拮抗剂DKK (0.01g/L)组、SP (10-10mol/L)+NK-1受体拮抗剂(Spantide 10-8mol/L)组,测定Wnt通路和凋亡通路基因蛋白改变,并再次设置对照组、SP(10-8mol/L)组、SP(10-10 mol/L)组、SP(10-12 mol/L)组确认Wnt通路蛋白相关改变情况。2. Western blot、Q-PCR检测Wnt通路和凋亡通路基因、蛋白表达提取实验组总RNA后进行逆转录反应,荧光定量测定Bcl-2、Bax、caspase-3、 caspase-8、caspase-9、β-catenin、GSK-3β、c-myc和cyclin D1含量。相关结果于12小时和24小时分别测定三次。3.免疫细胞荧光法检测β-catenin蛋白定位取三代细胞进行实验处理后,固定液处理15分钟后,使用0.4%Triton溶液破膜10分钟,脱脂牛奶封闭抗体30分钟,之后以1：300稀释的β-catenin一抗PBST溶液孵育过夜。PBS冲洗三次后,以FITC绿色荧光二抗室温下避光孵育30分钟,吸出液体后再次已DAPI染色15分钟,荧光显微镜下观察。实验结果：P物质作用于骨髓基质干细胞,促进经典Wnt通路β-catenin、p-GSK-3p、 c-myc和cyclin Dl基因和蛋白表达增高以及β-catenin转移入核,阻断Wnt通路后P物质抗凋亡效应减弱且Wnt通路表现水平减低。实验结论：骨髓基质干细胞可激活经典Wnt通路,从而调控去血清凋亡过程。