研究背景与目的：人类鼻咽癌是一种起源于鼻咽上皮细胞的恶性肿瘤,其病因目前认为与遗传、病毒及环境因素等有关。在中国的广东,鼻咽癌是头颈部最常见的肿瘤,发病率为50/10万,但在西方国家却为1/10万。鼻咽癌的恶性程度很高,常常侵犯周围组织、出现淋巴结肿大和发生远处转移。30%-60%的鼻咽癌患者最终出现远处转移。尽管鼻咽癌对放疗和化疗敏感,但治疗失败的原因还是由于局部复发和远处转移,这是导致鼻咽癌患者死亡的主要原因。然而发生转移和复发的细胞学和分子学机制尚不完全明了,因此深入研究鼻咽癌的生物学特性,了解该疾病的发生发展过程尤为重要,其中肿瘤干细胞研究将有可能成为突破点,为开发特异有效的靶向性治疗药物提供新的技术手段。肿瘤干细胞学说认为来源于器官的干细胞或祖细胞的肿瘤干细胞存在于肿瘤组织中,它们既是恶性肿瘤的起源,又成为恶性肿瘤治疗的靶器官。肿瘤干细胞数量虽少,仅占全部肿瘤细胞的极少数,但它却是造成肿瘤形成、发展和恶化的元凶。肿瘤干细胞对化疗耐药、放疗不敏感,具有强大的耐药性,即便消灭了大多数肿瘤细胞,肿瘤干细胞依然能够卷土重来,成为肿瘤复发和转移的一个重要原因。SP细胞(side population cell, SP cell,侧群细胞)是1996年Goodell等进行骨髓造血干细胞分离时,利用DNA荧光染料Hoechst33342和流式细胞技术发现的特殊细胞亚群。此后研究人员已经在人体多种正常组织和一些实体肿瘤中分离得到了SP细胞,SP细胞高表达干细胞相关基因,具有自我更新、多向分化等一系列干细胞的生物学特征。虽然已有人从鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma,NPC)中分离出SP细胞,但SP细胞和鼻咽癌转移和复发的分子生物学机制还不清楚。上皮细胞间质转型(epithelial-mesenchymal transitions,EMT)最早发现于发育生物学,是由Garry Greenburg与Elisabeth Hay正式提出的概念,他们经细胞实验证明上皮细胞的极性会暂时丧失,而表现出具有间质细胞特征的移行能力。EMT参与胚胎发育、组织重建和肿瘤转移,是一种基本的生理病理现象。其主要特征表现为上皮细胞表型的缺失及间质特性的获得。在EMT发生过程中,由于细胞外基质与上皮细胞间的连接及上皮细胞与细胞间的连接被破坏,细胞迁移到身体的其他部位。现有的研究证实,EMT在胚胎发育、上皮组织的伤口愈合及肿瘤细胞的侵袭和远处转移中起着重要作用。研究表明EMT过程中产生的细胞具有干细胞特性,同时证明EMT现象常常发生在干细胞中,这提示肿瘤进展与转移的发生与干细胞有关。由于肿瘤侵犯和远处转移与EMT的发生有着极为重要的关系,因而EMT成为肿瘤研究的热点。研究方法：将处于对数生长期生长状态良好的NPC CNE-2细胞经DNA荧光染料Hoechst33342染色后,以维拉帕米抑制试验做对照,进行流式细胞仪无菌分选,分别收集荧光阳性的NSP细胞和荧光阴性的SP细胞,并进行纯度测试,符合要求后,进行下列实验：1)进行克隆形成实验以测定两个细胞亚群克隆形成能力是否存在差别；2)活细胞状态下动态观察它们的形态差异；3)进行Matrigel transwell体外侵袭实验,对比两个细胞亚群的侵袭转移能力的差异；4)检测它们在干细胞相关基因及间质细胞相关基因表达方面的差异以及对三种化疗药的耐受力；5) Western Blot法检测两种细胞中上皮细胞钙粘连蛋白E-cadherin和间质细胞波形蛋白Vimentin的表达差异；6)将分选后的SP和NSP进行免疫荧光染色,检测E-cadherin和Vimentin荧光强弱的差异,验证Western Blot的结果；7)分析SP细胞与NSP的细胞周期差异,并比较两者细胞周期相关蛋白的表达差异；8)非肥胖性糖尿病／重症免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠体内成瘤实验,观察两细胞亚群在体内的致瘤能力。结果：我们发现NPC细胞系CNE-2有SP细胞(16.2%-22.6%)的存在,维拉帕米能够特异性阻断ABCG2的转运作用,使进入SP细胞的荧光染料不能被泵出细胞膜外,降低SP细胞比例,使SP细胞比例减少至0.0%。针对来源于CNE-2细胞系的SP细胞我们进行了系列研究,发现这些SP细胞具有肿瘤干细胞和间质细胞的一些关键特征,与NSP细胞相比,SP细胞具有较高的克隆形成能力(P<0.001),具有很强的侵袭能力(P<0.001),其既表达干细胞相关基因,同时也表达间质细胞的相关基因。SP细胞与NSP细胞相比具有更强的耐受5-氟尿嘧啶(5-Fu)、阿霉素等化疗药物的能。SP细胞中上皮细胞钙粘蛋白(E-cadherin)低表达,波形蛋白(Vimentin)高表达。而在NSP细胞中E-cadherin高表达,Vimentin低表达。SP细胞经培养后形态更接近间质细胞,呈现梭形。细胞周期检测结果表明,SP细胞处于S期的细胞数目较NSP明显高,细胞增殖更加活跃。SP细胞中与细胞周期相关的蛋白Cyclin D1和CDK2等表达升高,而细胞周期依赖激酶抑制分子p21和p27的表达降低,表明SP细胞生长活跃。在NOD/SCID小鼠体内成瘤实验表明SP细胞具有很强的致瘤能力,10,000个SP细胞就可以在小鼠皮下成瘤,而NSP细胞需要至少200,000细胞才能成瘤。SP细胞的肿瘤形成能力比NSP细胞高出至少20倍。结论：鼻咽癌CNE-2细胞系中存在着SP细胞亚群。经过对来源于CNE-2细胞系的SP细胞进行的研究发现该细胞系中SP细胞具有于细胞和间质细胞的特征,包括形态学变化,呈现为梭形,高克隆形成能力,很强的侵袭转移能力及在小鼠体内的强致瘤能力等。同时表达肿瘤干细胞相关基因和间质细胞相关基因,E-cadherin低表达和Vimentin高表达可能是鼻咽癌容易发生浸润和转移的机制之一。