前言：　　酒精性肝病(Alcoholic liver disease，ALD)是一类严重威胁人类健康的全球性疾病，包括脂肪肝、酒精性肝炎和肝硬化，并可能最终引起肝肿瘤。普遍认为，在ALD的发病过程中，由于体内活性氧(Reactive oxygen species，ROS)产生与清除不平衡而导致的氧化应激发挥关键作用。乙醇可能通过增加ROS的产生和/或降低抗氧化酶的活性促进氧化应激，进而引发酒精性肝损伤;然而，其具体分子机制尚不完全清楚。近年来，微小RNA(microRNA，miRNA)在人类疾病发生发展中的作用日益受到关注。miRNA是一类高度保守的内源性非编码小RNA，通过降解靶mRNA或抑制其翻译，在转录后水平调控基因表达。有学者报道乙醇可能通过调控miRNA表达进而参与ALD;然而，这些miRNA在酒精性肝损伤中的具体致病机制仍不明确。　　本研究第一部分拟根据生物信息学软件预测分析结果，着重围绕两个关键的抗氧化酶基因——谷胱甘肽还原酶(Glutathione，GSR)基因和细胞色素P450还原酶(Cytochrome P450 Oxidoreductase，POR)基因;通过载体构建和荧光素酶报告基因系统筛查可能与这两个基因3-非翻译区(3-UTR)靶向结合的miRNA;通过Western blot和抗氧化酶活检测试剂盒，鉴定这些miRNA对GSR和POR蛋白表达以及酶活性的影响;并通过乙醇处理体外培养肝细胞和酒精喂养实验大鼠，应用Realtime PCR、Western blot和氧化应激检测试剂盒等方法，明确该调控途径在酒精诱导肝细胞氧化应激中的作用。　　此外，干细胞作为一类具有自我复制和多向分化潜能的未成熟细胞，由于其在一定条件下可分化成为多种成体功能细胞，具有再生人体各种器官组织的潜在能力，因此可成为肝细胞损伤后修复研究的热点。羊水干细胞是介于胚胎干细胞与成体干细胞之间的一种特殊干细胞，没有胚胎干细胞的致瘤性，也避免伦理道德问题，同时又比成体干细胞更有活力，易于诱导成各胚层细胞，可被视为一种新型“治疗细胞”。　　目前，AFS体外肝向诱导分化常规诱导方法具体机制仍不完全清楚，且操作步骤繁琐，培养周期长，成本高，不利于转化应用于临床。因此，本研究第二部分拟通过培养大鼠羊水细胞，应用流式细胞术分选多潜能干细胞标志Oct4阳性细胞，Western blot验证Oct4，并对所获得的细胞克隆经流式细胞术鉴定其细胞表面其他干细胞标记蛋白以及经试剂盒检测端粒酶活性，以保证成功分离AFS;并在此基础上，以Oct4为切入点，鉴定调控其基因表达的关键microRNA，并初步探讨该调控途径在诱导AFS向肝细胞分化过程中的作用，以期创建干细胞肝向分化新策略，为将来肝细胞损伤修复的细胞治疗提供理论和实验依据。　　材料与方法：　　一、实验材料:　　1、人类肝癌Bel7402细胞、人胚肾HEK293细胞、大鼠正常肝细胞BRL、Wistar大鼠、大鼠胚胎心肌细胞H9C2　　2、microRNA模拟物及抑制剂等相关试剂　　3、Realtime PCR相关试剂　　4、RT-PCR相关试剂　　5、基因克隆及荧光素酶报告基因检测相关分子生物学试剂　　6、Western印迹相关试剂　　7、GSR POR酶活性检测试剂　　8、氧化应激损伤检测试剂盒　　9、流式细胞分选相关试剂　　10、Oct4阳性细胞定向诱导分化肝脏细胞相关试剂　　二、实验方法:　　1、生物信息学方法，预测GSR、POR及Oct4靶向调控microRNA。　　2、PCR克隆构建GSR、POR及Oct4的3非翻译区(untranslated region，UTR)荧光素酶报告基因载体，以及相关microRNA过表达载体，通过双荧光素酶报告基因系统验证microRNA靶向调控作用。　　3、通过对Bel7402、BRL转染microRNA过表达载体，以及应用microRNA抑制剂，通过Western印记正反向验证microRNA靶向调控GSR与POR表达。　　4、适量乙醇刺激Bel7402细胞与BRL细胞，Realtime PCR检测GSR、POR相关microRNA表达情况，Western blot检测GSR、POR蛋白表达水平。　　5、长期乙醇饲喂Wistar大鼠，并分别于0天、1天、1周、2周、3周、4周获取肝脏组织，Realtime PCR检测其GSR、POR对应microRNA表达情况，Western blot检测GSR、POR蛋白表达水平，通过体内实验验证乙醇诱导氧化应激损伤机制。　　6、获取Wistar大鼠孕16.5天子宫，抽取羊水原代培养，并采取极限稀释法获得若干细胞克隆，冻存并同时继续培养50代以上，流式细胞分选技术筛选Oct4阳性细胞后继续培养，获得克隆，Westernblot检测Oct4。　　7、流式细胞分选技术及免疫荧光检测羊水干细胞表面标记物CD29，34，44，90，105等。　　8、端粒酶活性检测试剂盒检测获得细胞克隆端粒酶活性，大鼠骨髓间充质干细胞、肝组织细胞及肝细胞系为对照。　　9、应用H9C2细胞作为Oct4内源性细胞系，验证前述microRNA调控Oct4验证实验。　　10、通过条件培养基定向诱导的方法，连续培养45天，并获取实验组与对照组蛋白及RNA。　　11、Realtime PCR方法检测肝向诱导后诱导剂对Oct4相关的microRNA的调控作用以及肝脏细胞标志蛋白mRNA，以及Western blot检测相应Oct4蛋白表达情况。　　结果：　　1、生物信息学方法，分别预测可靶向调控GSR、POR、Oct4的microRNA，其中共同调控GSR与POR的microRNA为miR-214，miR-324，miR-371-3p，miR-619;调控Oct4的microRNA为miR-24，miR-138，miR-339，miR-3657等。　　2、双荧光素酶报告基因系统结果显示，miR-214明显抑制pGL3-GSR与pGL3-POR荧光素酶活性((28％，P=0.004;30.9％，P=0.006)，miR-324抑制作用不明显，结果证明了miR-214作用位点位于GSR与POR3-UTR区。　　3、miR-214过表达载体转染Bel7402和BRL细胞，Western印记结果显示，GSR、POR蛋白表达水平被明显抑制，而同时应用miR-214特异性抑制剂可恢复GSR、POR蛋白水平。结果表明，在体外细胞实验中，miR-214靶向调控GSR、POR。　　4、乙醇刺激Bel7402细胞与BRL细胞后，诱发肝脏细胞抗氧化能力下降，细胞发生氧化应激损伤;Realtime PCR结果显示，miR-214上升3.72倍，miR-324上升2.56倍;同时Western结果显示，GSR、POR蛋白表达随乙醇刺激浓度与作用时间成下降趋势。表明乙醇上调了microRNA，同时miR靶蛋白GSR与POR表达受抑制。　　5、乙醇长期饲喂Wistar大鼠，肝脏组织mRNA Realtime结果显示，miR-214水平随乙醇摄入时间成明显上升趋势，同时Western blot结果显示，GSR蛋白表达随乙醇摄入时间成明显下降趋势，POR蛋白除摄入1周时间点呈略升高，其余各时间点变化趋势同GSR一致。　　6、通过极限稀释法成功获得若干高增殖效率细胞克隆，流式细胞分选技术，成功获得Oct4阳性目标克隆，流式细胞筛选证明细胞克隆为CD29，CD44等阳性，并通过冻存复苏证明细胞克隆可反复冻存利用;端粒酶活性检测发现，获得Oct4阳性克隆端粒酶明显高于肝组织细胞及肝细胞系，与骨髓间充质干细胞相当，证明所得细胞确实为羊水干细胞。　　7、应用复合诱导剂对细胞进行肝细胞定向诱导，检测诱导后肝细胞标志蛋白mRNA出现，miR-339表达显著升高，Oct4表达显著降低，提示诱导剂通过上调miR-339表达，进而通过下调Oct4表达，使细胞向肝细胞方向分化。　　结论：　　1、miR-214靶向结合于GSR和POR基因的3-UTR，并抑制GSR和POR蛋白表达和活性。　　2、乙醇通过诱导miR-214，下调GSR和POR蛋白表达和活性，进而促进肝细胞氧化损伤。　　3、本研究分离的Oct4阳性大鼠羊水干细胞具有干细胞特征;　　4、miR-339可靶向结合于Oct4基因3-UTR并下调Oct4蛋白表达;　　5、AFS向肝细胞诱导分化后miR-339表达水平显著升高，提示miR-339可能通过调控Oct4表达参与干细胞定向分化。