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苏云金芽胞杆菌(Bacillus Thuringiensis,简称Bt)是一种革兰氏阳性菌,属于蜡状芽胞杆菌群,由于其在形成芽胞的过程中能形成杀虫晶体蛋白而广泛的应用于生物防治。但是Bt菌剂在施用到土壤中后往往持效期较短,这与土壤中含有大量Bt噬菌体有极大关系。宿主对噬菌体的侵染有多种抵抗机制如流产感染、限制修饰系统等。CRISPR-Cas系统是近年来在原核细胞中发现的一套获得性免疫系统,广泛的存在于细菌及古菌基因组中并且能够阻止外源噬菌体及质粒的入侵。其免疫过程主要分为三个阶段:1)免疫适应阶段即新spacer的获取;2)crRNA的转录及成熟;3)降解外源DNA或RNA。根据切割外源DNA Cas蛋白的不同,CRISPR-Cas系统被分为三大类即Type Ⅰ,Type Ⅱ和Type Ⅲ。Type Ⅱ由于只需要一个Cas9蛋白就能实现对外源DNA的切割而被广泛的用作基因编辑。除了免疫功能之外,CRISPR-Cas系统在细菌生理中的作用逐渐被提出,如CRISPR-Cas系统能增强新凶手弗朗西斯茵(Francisella novicida)的毒力,抑制铜绿假单胞菌 PA14(Pseudomonas aeruginosa PA14)生物膜的形成等。1.Bc群中存在CRISPR-Cas系统并且具有免疫功能我们通过生物信息学分析发现蜡状芽胞杆菌群中有三个完整的Ⅰ型CRISPR-Cas系统。我们选取了具有完整Type Ⅰ-C CRISPR-Cas系统结构的蜡状芽胞杆菌VD115为材料对其免疫功能进行了相关研究:1)RT-PCR验证VD115 Type Ⅰ-C CRISPR-Cas系统中的Cas蛋白转录表达活跃;2)生物信息学分析与构建载体验证,证实了 VD115中Ⅰ型系统的PAM位点为TTN;3)质粒转化实验证实了 VD115中的Ⅰ型系统具有免疫功能,并将该系统克隆至野生菌株苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)YBT-1518中得到突变株BMB1685,证实VD115中的Ⅰ型系统在YBT-1518中也能发挥免疫作用;4)BMB1685与噬菌体共培养发现BMB1685对纯化噬菌体及混合噬菌体产生显著抗性;5)通过琼脂糖胶电泳、TA克隆测序及高通量测序证实BMB1685与噬菌体共培养后获取了新spacer。因此可以利用向Bt工程菌株中转入具有免疫功能的CRISPR-Cas系统来提高其对噬菌体的抗性而达到延长Bt菌株的田间应用的时效性。2.利用VD115中CRISPR-Cas系统构建敲除系统由于一般的基因操作技术很难对Bt基因组进行遗传改造,并且Bt工程菌一直存在安全性的争议,而CRISPR-Cas系统能够对基因进行高效、无痕编辑,且VD115中CRISPR-Cas系统具有免疫功能,因此可以利用该系统构建苏云金芽胞杆菌的高效敲除系统。由于Ⅰ型系统对DNA的切割不需要tracrRNA的参与,因此构建敲除系统时更易操作。我们利用VD115中的Type Ⅰ-C CRISPR-Cas系统成功的敲除了YBT-1518中的cry6Aa,证实了 Bc群中CRISPR-Cas系统能够用作高效的敲除系统,同时解决了 Bt基因组难进行遗传改造的问题。3.Bc群中CRISPR-Cas系统不利于宿主对环境的适应为了研究Bc群中CRISPR-Cas系统的潜在功能,我们对获取CRISPR-Cas系统的YBT-1518的生长情况及环境适应性进行了检测,发现:1)CRISPR-Cas系统对YBT-1518的生长有明显抑制作用;2)其群体特性如生物膜及群游特性都明显下降;3)耐盐及耐酸能力显著下降;4)在线虫体内定植能力降低。我们对Bc群中220个基因组分析,发现只有约11%的菌株含有该系统,远低于细菌中45%的比例。并且Bc群中的大部分系统并不完整,主要表现在Cas1,Cas2,Cas4等蛋白的缺失,说明这些菌株中的CRISPR-Cas系统失去了获得新spacer的能力,是一种免疫功能退化的表现。CRISPR-Cas系统广泛的存在于84%的古菌基因组中,仅存在于45%的细菌基因组中,并且细菌中病原菌的CRISPR-Cas系统占绝大多数。古菌和病原菌生活环境都相对较单一,不需要获得移动元件适应多样化的环境。因此,结合以上实验结果,我们认为Bc群中的CRISPR-Cas系统不利于宿主菌对环境的适应。