甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch)是豆科多年生草本植物,其根和根茎入药,具有补脾益气,清热解毒,祛痰止咳,调和诸药等功效,用于脾胃虚弱,倦怠乏力,心悸气短,咳嗽痰多等。近年来,对甘草药理作用深入的研究,表明黄酮类物质是甘草中非常有效的活性成分。甘草黄酮具有抗氧化作用,抗肿瘤、抗炎、抗变态反应、抗艾滋病毒等理作用,引起了人们的广泛关注和重视。甘草及其提取物目前广泛用于食品、药品、化妆品等行业,国内外对甘草需求持续升高,而现阶段栽培甘草与野生甘草质量存在较大差距,在生产上还没有真正意义上的栽培品种,严重限制了甘草产业的发展。许多研究表明,适度干旱胁迫可促进甘草有效成分的积累,提高甘草品质,但对该效应的分子机制尚无研究报道。本课题组前期应用转录组测序技术分析了适度干旱胁迫对甘草根转录组的调控,发现了甘草根黄酮类化合物生物合成的一些基因。本研究在此基础上进一步研究适度干旱胁迫对甘草根有效成分积累和黄酮类化合物生物合成相关基因表达的调控,初步揭示适度干旱胁迫调控甘草黄酮类化合物积累的分子机制。本研究以6月龄栽培甘草为实验材料进行适度干旱胁迫(土壤相对含水量:40%~45%)。采用HPLC法测定对干旱胁迫30、50、70d的甘草根有效成分的含量,明确各成分的动态变化规律。胁迫50d时,甘草苷含量增加并不显著,而胁迫70d时,甘草苷含量迅速增加。甘草酸的含量则呈现先减少后增加的趋势。甘草有效成分的含量均在70d的干旱胁迫处理下达到最高,表明延长干旱胁迫时间可以促进甘草根有效成分的积累。在此基础上,本实验从转录组测序结果中筛选了异黄酮2’-羟化酶(I2’H)、类异黄酮葡糖基转移酶(IFG)、查尔酮异构酶(CHI)、黄酮合酶2(FS2)等甘草黄酮类化合物生物合成途径的一些关键酶的基因,采用RT-PCR技术检测这些基因在不同干旱胁迫时间的表达差异。结果表明,在胁迫50d时,CHI基因的表达量达最高;适当的干旱胁迫时间可以促进FS2的表达,而过长的干旱胁迫时间会抑制该基因的表达;适当的干旱胁迫下,IFG基因的持续高水平表达;胁迫50d以及70d时,I2’H的表达量增加,而胁迫30d的表达量较低。根据以上半定量RT-PCR的结果,适度的干旱胁迫的条件,导致黄酮类化合物生物合成途径的关键酶基因表达上调,从而促进了甘草黄酮类化合物的积累。以GuI2’H cDNA序列为研究对象,成功克隆该基因,为后续的研究奠定了基础。同时应用生物信息学软件和网络工具分析其cDNA序列及其编码的蛋白质的结构、功能及分子进化特征。GuI2’H cDNA全长2425 bp,含有1521 bp的开放读码框(ORF),编码538个氨基酸残基的多肽。该蛋白质为跨内质网膜蛋白,与其它物种的I2’H具有高度的序列同源性,与同科植物黄芩、大豆的I2’H亲缘关系较近。结果表明,甘草异黄酮2’-羟化酶cDNA编码异黄酮2’-羟化酶,属于细胞色素P450 81E家族成员。