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本研究分为三部分：
第一部分: SaIusin-β在LDLR-/-动脉粥样硬化模型小鼠主动脉的表达
目的:探讨心血管活性肽salusin-β在LDLR-/-动脉粥样硬化(AS)模型小鼠主动脉内表达情况。
方法:6只雄性LDLR-/-小鼠给予高脂肪饮食造模12周以促成动脉粥样斑块的形成,6只C57BL/6J小鼠为正常对照组,予以普通饲料。12周后处死各实验组小鼠,采用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、western blot及免疫组化方法分别检测各组小鼠主动脉组织中的preprosalusin mRNA及蛋白水平的表达情况。
结果:
(1)RT-PCR结果显示:Preprosalusin mRNA的表达在模型组较正常对照组明显增加(P＜0.01),有统计学意义。
(2)Western blot结果显示:与正常对照组相比,模型组小鼠主动脉内preprosalusin蛋白含量明显增加(P＜0.01),差异具有统计学意义。
(3)免疫组织化学分析显示:各组小鼠在内皮细胞和VSMCs中均有salusin-β阳性染色,正常对照组、模型组的salusin-β积分光密度值分别为:6520.19±1666.93、19446.33±5091.595,组间存在显著性差异(P＜0.01)。
结论: LDLR-/-AS小鼠主动脉salusin-β的表达上调。
第二部分: Salusin-β对LDLR-/-小鼠动脉粥样硬化发展的影响
目的:探讨心血管活性肽salusin-β对LDLR-/-小鼠AS发展的影响。
方法:(1)将12只雄性LDLR-/-小鼠随机分为两组:模型组和salusin-β组,给予高脂肪饮食,另取6只C57BL/6J小鼠作为正常对照组,予以普通饲料喂养。Salusin-β组小鼠每天皮下注射1μg/kg的salusin-β,模型组小鼠皮下注射同体积的PBS。12周后处死各组小鼠,分别检测血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)及高密度脂蛋白(HDL)含量;HE、油红O染色分析各组小鼠主动脉AS斑块病变情况。
结果:
(1)模型组小鼠血清中TG、TC、LDL和HDL的浓度分别为(8.39±2.51)mmol/L,(24.05±13.86)mmol/L,(24.05±13.86)mmol/L和(7.28±4.46)mmol/L,与正常对照组相比,除HDL外,其余血脂水平均显著升高(P＜0.01);而salusin-β组小鼠血清中TG、TC、LDL和HDL的浓度分别为(9.49±4.80)mmol/L,(28.66±15.37)mmol/L,(21.08±15.03)mmol/L和(10.45±7.72)mmol/L,与模型组相比虽然有所增加,但是变化无统计学意义(P＞0.05)。模型组和salusin-β组小鼠的体重与正常对照组相比虽然有所增加,但亦无统计学意义(P＞0.05)。
(2)油红O染色结果表明,模型组和salusin-β组的斑块面积/内膜面积明显大于正常对照组(P＜0.01),而且salusin-β组斑块面积/内膜面积大于模型组,差异有统计学意义(P＜0.05)。
(3)HE染色结果显示,连续给药12周后,中膜厚度各组间没有差异(P＞0.05);模型组和salusin-β组的内膜厚度与对照组比较明显增厚(P＜0.01);salusin-β组内膜厚度明显大于模型组(P＜0.01);模型组和salusin-β组的I/M值明显高于对照组(P＜0.05),salusin-β组与模型组的I/M值比较也有增大,差异有统计学意义(P＜0.05)。
结论:皮下注射salusin-β可增加LDLR-/-小鼠的AS斑块面积,增加主动脉内膜厚度。
第三部分: Salusin-β对血管平滑肌细胞增殖的影响
目的:探讨心血管活性肽salusin-β对血管平滑肌细胞(VMSCs)增殖的影响。
方法:体外组织贴块法培养大鼠中膜VMSCs,细胞生长至近融合状态时用0.25％胰蛋白酶消化传代,第3代细胞用于本实验,实验共分为4组:①空白对照组:给予PBS;②10-10mol/L salusin-β组;③10-9mol/L salusin-β组;④10-8mol/Lsalusin-β组。实验方法包括:(1)MTT比色法检测VSMCs的增殖状况;(2)Western blot法检测p-ERK1/2的表达;(3)RT-PCR法检测c-fos、c-myc mRNA表达。
结果:
(1)与对照组相比,salusin-β具有明显的促进VSMCs增殖的作用,而且在同一时间点,随着salusin-β浓度(10-10、10-910-8mol/L)增加,VSMCs的吸光度值(A)增大(P＜0.01)。
(2)Western blot结果显示,与对照组相比,VMSCs经浓度为10-9和10-8mol/L的salusin-β作用48 h后p-ERK1/2表达均明显增加(P＜0.01),而且salusin-β的浓度越大,p-ERK1/2表达增加越明显。
(3)增殖相关基因c-myc表达的光密度值随着salusin-β浓度的增加(10-10、10-9、10-8mol/L)依次为:0.67±0.14、0.96±0.01、1.45±0.02,与对照组的0.49±0.05相比,明显上调(P＜0.05);c-fos基因表达的光密度值分别为:0.66±0.06、0.84±0.01、1.24±0.01,与对照组0.24±0.01相比,亦明显上调,差异具有统计学意义(P＜0.01)。
结论: Salusin-β可能通过活化ERK1/2,诱导c-myc、c-fos基因表达,从而促进VSMCs增殖。