胆管癌是指发生在肝外胆管的肿瘤，恶性程度高，早期诊断和治疗都比较困难。其危险因素包括先天性胆管囊肿，胆石症和原发性硬化性胆管炎等等。胆管癌的发病率在全球范围内有逐渐上升趋势。最近，越来越多的学者都在研究microRNA与肿瘤的关系。microRNA是一类内源性的非编码RNA，由19-25个左右核苷酸组成，通过与靶mRNA的3-UTR碱基互补配对，抑制mRNA翻译或直接使其降解，使靶基因的表达在转录后水平受到抑制，从而调控基因表达。尽管目前对microRNA生物学功能的了解仍然十分有限，但是可以肯定的是，microRNA在生物体的发育、生长、分化、凋亡及肿瘤形成等众多方面具有非常重要的调节作用，特别是在一些恶性肿瘤中，microRNA通过调控不同的靶基因而起到类似于原癌基因或抑癌基因的作用。许多研究表明，miR-138与多种肿瘤有关，如舌癌、肝癌、鼻咽癌等。然而，miR-138在胆管癌中的表达模式迄今未见报道。　　本文拟对miR-138在胆管癌中的表达及相关功能进行实验研究。由此，我们设计如下实验:　　1.研究miR-138在人胆管癌细胞系及正常胆管上皮细胞中的表达特点，探讨其表达水平与肿瘤细胞的关系;转染miR-138成熟体(mimics)和miR-138抑制剂(inhibitor)，观察其对胆管癌细胞增殖、凋亡、侵袭及迁移能力的影响。　　2.在生物信息学靶基因预测的基础上，发现MiR-138的可能靶基因RhoC。构建携带RhoC3-UTR序列的psiCHECK2报告基因载体，利用荧光素酶报告基因技术，验证miR-138与RhoC基因的靶向关系;同时转染miR-138 mimics和miR-138 inhibitor，检测胆管癌细胞中RhoC基因的变化情况。　　3.研究miR-138及其靶基因RhoC在胆管癌组织中的表达，探讨两者与胆管癌临床特征及病理的关系。　　第一章MiR-138表达与胆管癌细胞系生物学行为的实验研究　　目的:1.研究miR-138在人胆管癌细胞系及正常胆管上皮细胞中的表达特点，探讨其表达水平与肿瘤细胞的关系。　　2.探讨miR-138对胆管癌细胞增殖、凋亡、侵袭及迁移能力的影响。　　方法:1.采用实时定量PCR(Real-Time PCR)检测胆管癌细胞系(HCCC-9810，RBE，QBC939)及正常胆管上皮细胞(HIBEC)中miR-138的表达;　　2.细胞实验，将实验分成四组:1）miR-138组:瞬时转染miR-138 mimic的胆管癌细胞;2）miR-138 inhibitor（抑制）组:在miR-138组的基础上转染miR-138 inhibitor的胆管癌细胞;3）阴性对照组(NC):转染空质粒的胆管癌细胞;4）空白对照组(Con):未转染的胆管癌细胞。以Real-Time PCR检测转染效果。运用MTT、流式细胞学、Transwell侵袭实验、细胞划痕实验分别检测各组胆管癌细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移能力的变化。　　结果:1.miR-138在胆管癌细胞系中表达降低，明显低于正常胆管上皮细胞(P＜0.05)，说明miR-138在胆管癌细胞中可能起抑制作用;其中在QBC939细胞表达最低，选取其作为后续实验的研究对象。　　2.miR-138组中的miR-138表达明显高于对照组和抑制组;而抑制组中miR-138的表达明显低于对照组(P＜0.05)，说明转染成功。　　3.QBC939细胞实验结果:1）MTT法绘制生长曲线结果显示，miR-138组细胞的增殖低于对照组;miR-138 inhibitor组细胞增殖高于对照组，结果有显著差异(P＜0.05)。2)流式细胞结果，各组凋亡率分别为:Con4.22±0.65％，NC4.91±0.71％，miR-138组18.42±2.37％，miR-138 inhibitor组2.98±0.43％。miR-138组的凋亡率明显高于对照组及抑制组(P＜0.05);3)Transwell侵袭实验结果，miR-138组的侵袭能力明显受到抑制，而miR-138抑制组的侵袭能力明显加强，两组与Con和NC组对比有显著性差异(P＜0.05)，4)细胞划痕实验:培养24h后，inhibitor组细胞间平均距离为2.79±0.05mm，较Con组3.85±0.03mm和NC组3.83±0.03mm组有明显差异(P＜0.05)，而此时miR-138组4.45±0.04mm与Con和NC组间差异不明显;当培养48h后，miR-138组与Con和NC组间出现明显差异(P＜0.05)，此时inhibitor组与对照组间呈显著性差异(P＜0.01)。以上实验Con和NC组均无显著性差异。　　结论:1.miR-138在胆管癌细胞系HCCC-9810、RBE、QBC939中的表达明显低于正常肝内胆管上皮细胞。　　2.miR-138可抑制胆管癌细胞QBC939的增殖、侵袭及迁移能力，促进细胞凋亡。　　第二章 miR-138与RhoC靶基因关系的鉴定　　目的:1.通过生物信息学找出miR-138的可能靶基因，并对其靶向关系加以验证。　　2.检测靶基因在胆管癌细胞系中的表达。　　方法:1.运用miRNA特异性靶点预测平台:PicTar，miRanda和RargetScan预测miR-138的靶基因。　　2.靶基因的鉴定:1）采用荧光素酶报告基因技术，检测miR-138与其靶基因结合后荧光素变化。　　3.运用Real-Time PCR和Western Blot检测miR-138与其靶基因结合后靶基因mRNA和蛋白的变化情况。　　结果:1.找到miR-138的可能靶基因RhoC;　　2.荧光素酶活性检测结果:各组的Luciferase值分别为:Con组=2.236±0.008， miR-138组=1.328±0.011、 inhibitor组=2.235±0.008、NC组=2.227±0.005、NC inhibitor组=2.232±0.001。其中miR-138组较Con组和NC组比较，具有显著性差异(P＜0.05)　　3.Real-Time PCR结果， miR-138 inhibitor组中的RhoCmRNA表达水平明显高于Con组和NC组(P＜0.05);而转染miR-138mimics组中RhoC mRNA表达水平明显低于Con组和NC组，结果有显著性差异(P＜0.05)　　4.miR-138组的RhoC蛋白表达水平明显受到抑制，而miR-138 inhibitor组的细胞中RhoC蛋白表达水平显著上升，与Con和NC组对比有统计学差异(P＜0.05)　　结论:1.RhoC基因是miR-138的靶基因之一，其3-UTR序列中存在miR-138的作用靶点。　　2.QBC939细胞中miR-138与RhoC mRNA和蛋白表达水平呈显著负相关。　　第三章 MiR-138和RhoC在胆管癌中的表达及临床意义　　目的:检测胆管癌组织和正常胆管组织中miR-138和RhoC的表达，分析其与临床病理特征的关系。　　方法:RNA原位杂交法检测76例胆管癌和10例正常胆管石蜡切片标本中miR-138的表达;免疫组化SP检测标本中RhoC的表达　　结果:1.MiR-138在76例胆管癌中有42.1％(32/76)阳性表达，而10例正常胆管组织中有90.0％(9/10)阳性表达，两者间有明显差异(P＜0.05)。　　2.RhoC在76胆管癌组中有73.7％(56/76)阳性表达，而正常胆管组织中只有20.0％(2/10)阳性表达，两者间有显著差异(P＜0.05)。　　3.miR-138在高中-分化组、无淋巴结转移组和无远处转移组的阳性表达率为52.3％、55.3％和51.6％，明显高于低分化组、有淋巴结转移组和有远处转移组的28.1％、24.1％和16.7％(P＜0.05)。RhoC在高中-分化组、无淋巴结转移组和无远处转移组的阳性表达率为63.6％％、59.6％和68.8％，而在低分化组、有淋巴结转移组和有远处转移组分别为87.5％、96.6％、100％，两者比较差异显著(P＜0.05)。　　结论:1.miR-138在胆管癌中低表达;RhoC在胆管癌中高表达。　　2.miR-138、RhoC与胆管癌组织学分化程度、淋巴结转移和远处转移有关。　　3.miR-138和RhoC在胆管癌组织中的表达呈负相关性。