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研究背景：
下肢静脉曲张是血管外科常见的疾病之一，多数发生于大隐静脉及其走型区域浅表静脉，也可发生于小隐静脉。血管平滑肌细胞表型转化及随之发生的增殖与迁移是下肢静脉曲张等血管重塑性疾病的共同病理生理过程。正常情况下，血管平滑肌细胞以收缩型为主，以维持血管壁的弹性和调节血压血流；而在应对血管损伤或处于病理状态时，血管平滑肌细胞可通过降低收缩型和维持异常增殖、迁移而从收缩型转化为合成型，即发生“表型转化”，进而导致血管重塑。
叉头框C2(forkhead box C2, FOXC2)是近年来在研究脂肪细胞代谢过程中发现的人类forkhead家族的转录因子，与血管和淋巴管的发生发展密切联系。FOXC2基因是与原发性下肢浅表静脉和深静脉瓣膜发育缺损和功能不全关系最为密切的主要病因基因。研究表明在静脉内皮细胞中过表达FOXC2可上调Notch信号通路相关蛋白Dll4、Hey2的表达，提示FOXC2-Notch通路与静脉曲张有关。
研究报道长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)在原发性静脉曲张的大隐静脉中存在差异表达，提示lncRNA参与静脉曲张的调节。FOXC2反义RNA1(FOXC2 Antisense RNA 1，FOXC2-AS1)是近年来新发现的一个lncRNA，已有研究报道，FOXC2的表达受到其反义lncRNAFOXC2-AS1的调节，FOXC2-AS1可与FOXC2mRNA组成双链结构，促进FOXC2mRNA的稳定性。但其在静脉曲张中的作用还未见报道。综合以上研究进展，本研究推测在大隐静脉曲张中FOXC2-AS1可通过调节FOXC2的表达，调控Notch信号通路，从而调节静脉平滑肌细胞表型转化以及增殖和迁移。
研究目的：
观察正常静脉和曲张静脉的形态、平滑肌细胞表型转化和FOXC2-AS1表达的差异；探究FOXC2-AS1过表达对大隐静脉平滑肌细胞由收缩型向合成表型转化、细胞增殖和迁移的影响；初步探讨FOXC2-AS1的作用机制是否与调节FOXC2和Notch信号通路有关。
第一部分FOXC2-AS1在曲张静脉组织中的表达及大隐静脉平滑肌细胞表型观察
方法:
1.收集大隐静脉标本，曲张静脉取自原发性大隐静脉曲张患者，对照静脉取自未患静脉曲张的心脏冠状动脉搭桥患者。
2.HE染色观察曲张静脉和正常静脉的形态差异。
3.免疫组化观察曲张静脉和正常静脉中收缩型标志物SM22α和合成型标志物OPN的定位和表达差异，以分析血管平滑肌细胞的表型。
4.采用qRT-PCR检测FOXC2-AS1的RNA表达水平。
结果:
1.常规病理结果显示，相对于正常大隐静脉(n=10)。原发性大隐静脉曲张患者(n=10)的大隐静脉内膜异常增厚，差异有统计学意义(P＜0.01)，中膜、外膜血管平滑肌细胞增生。
2.免疫组化染色表明，正常大隐静脉组织中SM22α蛋白染色呈棕黄色或深棕色的强阳性信号，而几乎未见OPN阳性细胞。而在原发性大隐静脉曲张患者的大隐静脉组织中SM22α蛋白染色阳性信号少，OPN则广泛分布在血管壁新生中膜和外膜的平滑肌细胞中。对平均光密度(OD)定量分析表明静脉曲张患者的大隐静脉组织中SM22α蛋白的表达显著低于正常组，而OPN蛋白的表达显著高于正常组，差异有统计学意义(P＜0.01)。
3.qRT-PCR结果显示，原发性大隐静脉曲张患者的大隐静脉中FOXC2-AS1的表达水平显著高于正常组,差异有统计学意义(P＜0.01)。
第二部分FOXC2-AS1过表达对大隐静脉平滑肌细胞表型转化、增殖和迁移的影响
方法:
1.分离人正常大隐静脉平滑肌细胞，α-SMA免疫荧光鉴定。
2.构建FOXC2-AS1过表达载体及对照，并转染大隐静脉平滑肌细胞，qRT-PCR检测过表达效率。Westernblot检测SM22α和OPN蛋白的表达。MTT法检测平滑肌细胞增殖情况。Transwell实验检测平滑肌细胞迁移能力。
结果:
1.α-SMA免疫荧光鉴定证实成功分离培养出人大隐静脉平滑肌细胞。
2.qRT-PCR结果表明，转染FOXC2-AS1过表达载体的细胞中FOXC2-AS1的表达显著高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.01)，提示FOXC2-AS1被成功过表达。
3.Westernblot结果表明，FOXC2-AS1过表达显著下调人正常大隐静脉平滑肌细胞中收缩型标志物SM22α，显著上调合成型标志物OPN，差异有统计学意义(P＜0.05)。提示FOXC2-AS1过表达可促进大隐静脉平滑肌细胞由收缩型向合成型表型转化。
4.MTT法表明，FOXC2-AS1过表达显著促进人正常大隐静脉平滑肌细胞的增殖，差异有统计学意义(P＜0.01)。
5.Transwell迁移实验表明，FOXC2-AS1过表达显著提高人正常大隐静脉平滑肌细胞的迁移能力，差异有统计学意义(P＜0.01)。
第三部分FOXC2-AS1对大隐静脉平滑肌细胞作用机制的初步探究
方法:
1.采用qRT-PCR、Westernblot分别检测正常静脉和曲张静脉中FOXC2的mRNA和蛋白表达。
2.在大隐静脉平滑肌细胞中转染FOXC2-AS1过表达载体及对照，qRT-PCR和Westernblot分别检测FOXC2的mRNA和蛋白表达。
3.在大隐静脉平滑肌细胞中共转染FOXC2-AS1过表达载体与FOXC2siRNA。Westernblot检测SM22α、OPN的表达，MTT法检测细胞增殖，Transwell实验检测细胞迁移。
4.在大隐静脉平滑肌细胞中共转染FOXC2-AS1过表达载体与FOXC2siRNA，Westernblot检测Notch通路相关蛋白Dll4、Notch1、Hey2、EphrinB2的表达。
5.采用Notch信号通路抑制剂FLI-06处理转染FOXC2-AS1过表达载体及对照的大隐静脉平滑肌细胞。Westernblot检测SM22α、OPN的表达，MTT法检测细胞增殖改变，Transwell实验检测细胞迁移能力。
结果:
1.原发性大隐静脉曲张患者的大隐静脉中FOXC2的mRNA和蛋白水平显著高于正常组，差异有统计学意义(P＜0.01)。
2.在大隐静脉平滑肌细胞中，FOXC2-AS1过表达可上调FOXC2的mRNA和蛋白水平，差异有统计学意义(P＜0.01)。
3.FOXC2-AS1过表达促进大隐静脉平滑肌细胞由收缩向合成表型转化，促进细胞增殖和迁移，而该效果可以被FOXC2siRNA和Notch通路抑制剂FLI-06逆转，差异有统计学意义(P＜0.05)，提示FOXC2-AS1过表达促进大隐静脉平滑肌细胞由收缩向合成表型转化、促进细胞增殖和迁移的作用，至少部分地是通过上调FOXC2表达和激活Notch通路实现的。
4.FOXC2-AS1过表达可激活Notch信号通路，而这个效果可以被FOXC2siRNA逆转，差异有统计学意义(P＜0.05)，提示FOXC2-AS1过表达通过上调FOXC2，激活Notch信号通路。
全文结论：
1.相比正常静脉，曲张静脉组织中内膜增厚，血管平滑肌细胞在中膜、外膜中增生，合成型平滑肌细胞增多，FOXC2-AS1和FOXC2的表达上调。
2.FOXC2-AS1过表达通过上调FOXC2，激活Notch通路，促进大隐静脉平滑肌细胞由收缩型向合成型表型转化，并促进细胞增殖和迁移。
下肢静脉曲张是血管外科常见的疾病之一，多数发生于大隐静脉及其走型区域浅表静脉，也可发生于小隐静脉。血管平滑肌细胞表型转化及随之发生的增殖与迁移是下肢静脉曲张等血管重塑性疾病的共同病理生理过程。正常情况下，血管平滑肌细胞以收缩型为主，以维持血管壁的弹性和调节血压血流；而在应对血管损伤或处于病理状态时，血管平滑肌细胞可通过降低收缩型和维持异常增殖、迁移而从收缩型转化为合成型，即发生“表型转化”，进而导致血管重塑。
叉头框C2(forkhead box C2, FOXC2)是近年来在研究脂肪细胞代谢过程中发现的人类forkhead家族的转录因子，与血管和淋巴管的发生发展密切联系。FOXC2基因是与原发性下肢浅表静脉和深静脉瓣膜发育缺损和功能不全关系最为密切的主要病因基因。研究表明在静脉内皮细胞中过表达FOXC2可上调Notch信号通路相关蛋白Dll4、Hey2的表达，提示FOXC2-Notch通路与静脉曲张有关。
研究报道长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)在原发性静脉曲张的大隐静脉中存在差异表达，提示lncRNA参与静脉曲张的调节。FOXC2反义RNA1(FOXC2 Antisense RNA 1，FOXC2-AS1)是近年来新发现的一个lncRNA，已有研究报道，FOXC2的表达受到其反义lncRNAFOXC2-AS1的调节，FOXC2-AS1可与FOXC2mRNA组成双链结构，促进FOXC2mRNA的稳定性。但其在静脉曲张中的作用还未见报道。综合以上研究进展，本研究推测在大隐静脉曲张中FOXC2-AS1可通过调节FOXC2的表达，调控Notch信号通路，从而调节静脉平滑肌细胞表型转化以及增殖和迁移。
研究目的：
观察正常静脉和曲张静脉的形态、平滑肌细胞表型转化和FOXC2-AS1表达的差异；探究FOXC2-AS1过表达对大隐静脉平滑肌细胞由收缩型向合成表型转化、细胞增殖和迁移的影响；初步探讨FOXC2-AS1的作用机制是否与调节FOXC2和Notch信号通路有关。
第一部分FOXC2-AS1在曲张静脉组织中的表达及大隐静脉平滑肌细胞表型观察
方法:
1.收集大隐静脉标本，曲张静脉取自原发性大隐静脉曲张患者，对照静脉取自未患静脉曲张的心脏冠状动脉搭桥患者。
2.HE染色观察曲张静脉和正常静脉的形态差异。
3.免疫组化观察曲张静脉和正常静脉中收缩型标志物SM22α和合成型标志物OPN的定位和表达差异，以分析血管平滑肌细胞的表型。
4.采用qRT-PCR检测FOXC2-AS1的RNA表达水平。
结果:
1.常规病理结果显示，相对于正常大隐静脉(n=10)。原发性大隐静脉曲张患者(n=10)的大隐静脉内膜异常增厚，差异有统计学意义(P＜0.01)，中膜、外膜血管平滑肌细胞增生。
2.免疫组化染色表明，正常大隐静脉组织中SM22α蛋白染色呈棕黄色或深棕色的强阳性信号，而几乎未见OPN阳性细胞。而在原发性大隐静脉曲张患者的大隐静脉组织中SM22α蛋白染色阳性信号少，OPN则广泛分布在血管壁新生中膜和外膜的平滑肌细胞中。对平均光密度(OD)定量分析表明静脉曲张患者的大隐静脉组织中SM22α蛋白的表达显著低于正常组，而OPN蛋白的表达显著高于正常组，差异有统计学意义(P＜0.01)。
3.qRT-PCR结果显示，原发性大隐静脉曲张患者的大隐静脉中FOXC2-AS1的表达水平显著高于正常组,差异有统计学意义(P＜0.01)。
第二部分FOXC2-AS1过表达对大隐静脉平滑肌细胞表型转化、增殖和迁移的影响
方法:
1.分离人正常大隐静脉平滑肌细胞，α-SMA免疫荧光鉴定。
2.构建FOXC2-AS1过表达载体及对照，并转染大隐静脉平滑肌细胞，qRT-PCR检测过表达效率。Westernblot检测SM22α和OPN蛋白的表达。MTT法检测平滑肌细胞增殖情况。Transwell实验检测平滑肌细胞迁移能力。
结果:
1.α-SMA免疫荧光鉴定证实成功分离培养出人大隐静脉平滑肌细胞。
2.qRT-PCR结果表明，转染FOXC2-AS1过表达载体的细胞中FOXC2-AS1的表达显著高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.01)，提示FOXC2-AS1被成功过表达。
3.Westernblot结果表明，FOXC2-AS1过表达显著下调人正常大隐静脉平滑肌细胞中收缩型标志物SM22α，显著上调合成型标志物OPN，差异有统计学意义(P＜0.05)。提示FOXC2-AS1过表达可促进大隐静脉平滑肌细胞由收缩型向合成型表型转化。
4.MTT法表明，FOXC2-AS1过表达显著促进人正常大隐静脉平滑肌细胞的增殖，差异有统计学意义(P＜0.01)。
5.Transwell迁移实验表明，FOXC2-AS1过表达显著提高人正常大隐静脉平滑肌细胞的迁移能力，差异有统计学意义(P＜0.01)。
第三部分FOXC2-AS1对大隐静脉平滑肌细胞作用机制的初步探究
方法:
1.采用qRT-PCR、Westernblot分别检测正常静脉和曲张静脉中FOXC2的mRNA和蛋白表达。
2.在大隐静脉平滑肌细胞中转染FOXC2-AS1过表达载体及对照，qRT-PCR和Westernblot分别检测FOXC2的mRNA和蛋白表达。
3.在大隐静脉平滑肌细胞中共转染FOXC2-AS1过表达载体与FOXC2siRNA。Westernblot检测SM22α、OPN的表达，MTT法检测细胞增殖，Transwell实验检测细胞迁移。
4.在大隐静脉平滑肌细胞中共转染FOXC2-AS1过表达载体与FOXC2siRNA，Westernblot检测Notch通路相关蛋白Dll4、Notch1、Hey2、EphrinB2的表达。
5.采用Notch信号通路抑制剂FLI-06处理转染FOXC2-AS1过表达载体及对照的大隐静脉平滑肌细胞。Westernblot检测SM22α、OPN的表达，MTT法检测细胞增殖改变，Transwell实验检测细胞迁移能力。
结果:
1.原发性大隐静脉曲张患者的大隐静脉中FOXC2的mRNA和蛋白水平显著高于正常组，差异有统计学意义(P＜0.01)。
2.在大隐静脉平滑肌细胞中，FOXC2-AS1过表达可上调FOXC2的mRNA和蛋白水平，差异有统计学意义(P＜0.01)。
3.FOXC2-AS1过表达促进大隐静脉平滑肌细胞由收缩向合成表型转化，促进细胞增殖和迁移，而该效果可以被FOXC2siRNA和Notch通路抑制剂FLI-06逆转，差异有统计学意义(P＜0.05)，提示FOXC2-AS1过表达促进大隐静脉平滑肌细胞由收缩向合成表型转化、促进细胞增殖和迁移的作用，至少部分地是通过上调FOXC2表达和激活Notch通路实现的。
4.FOXC2-AS1过表达可激活Notch信号通路，而这个效果可以被FOXC2siRNA逆转，差异有统计学意义(P＜0.05)，提示FOXC2-AS1过表达通过上调FOXC2，激活Notch信号通路。
全文结论：
1.相比正常静脉，曲张静脉组织中内膜增厚，血管平滑肌细胞在中膜、外膜中增生，合成型平滑肌细胞增多，FOXC2-AS1和FOXC2的表达上调。
2.FOXC2-AS1过表达通过上调FOXC2，激活Notch通路，促进大隐静脉平滑肌细胞由收缩型向合成型表型转化，并促进细胞增殖和迁移。