咀嚼时上、下牙的接触关系或者上、下牙发生接触的动作过程被称为咬合。咀嚼时咬合接触是不断发生变化的,在咬合的指导下,上、下颌发生咀嚼运动,对口腔内的食物产生研磨、挤压、捣碎等力的作用。在此过程中,牙周本体觉(proprioceptive sensation)感受器负责搜集与食物的厚度、硬度等相关的以及对牙齿压力的大小和方向相关的信号,本体觉感觉神经末梢中的囊泡膜谷氨酸转运体(VGLUTs)将刺激信号通过三叉神经中脑核(Vme)周围突传递到Vme神经元胞体,再经过其中枢突将信号传递至包括三叉神经运动核(Vmo)在内的部分运动核团。运动核团发出轴突终末至咀嚼肌,牵拉下颌骨,带动整口牙列完成咀嚼过程。在此过程中,VGLUTs发挥着重要作用,其分为I、II、III(VGLUTl、VGLUT2、VGLUT3)三种亚型。其中VGLUTl和VGLUT2作为谷氨酸能轴突终末的特异性标识物主要分布于谷氨酸能神经元的轴突终末。三叉神经运动核(Vmo)作为重要的三叉系统内运动核团,可分为背外侧核(Mo5DL)和腹内侧核(Mo5VM)两部分。VGLUTl主要分布于三叉神经运动核(Vmo)的背外侧部,VGLUT2则分布于整个三叉神经运动核(Vmo)。咀嚼肌作为运动下颌的主要肌肉,在日常言语交流、饮食咀嚼等方面发挥着不可或缺的作用。咀嚼肌由两组作用相反的肌肉组成:颞肌、咬肌、翼内肌、二腹肌后腹在收缩时上提下颌,故称为闭口肌群,由Vmo背外侧核团神经元运动轴突终末支配;二腹肌前腹、下颌舌骨肌、颏舌骨肌的着力点主要在颏部,收缩时可下降下颌,故称为开口肌群,由Vmo腹内侧核团神经元运动轴突终末支配。对颞肌、咬肌、翼内肌等闭口肌神经元进行逆标,结果显示神经元标记物分布在背外侧核的某些不同区域;对二腹肌前腹等开口肌神经元进行逆标,结果显示神经元标记物分布在腹内侧核的某些区域。翼外肌辅助其它咀嚼肌可完成前伸颌、侧方颌等运动,多年来一直无法明确的将其定义为开口肌或闭口肌,由于特殊的解剖位置,关于支配翼外肌的神经元分布位置目前尚无定论。翼外肌是本研究的核心内容,因此,找到支配翼外肌的神经元运动轴突终末来源于哪个核团是本研究的关键。颞下颌关节是人体最为复杂的关节之一,在包括翼外肌在内的咀嚼肌牵拉下行使着语言、咀嚼、吞咽、表情等日常不可或缺的复杂生理功能。在口腔颌面部常见的疾病中,颞下颌关节强直(TMJA)是一种至今仍未被攻克的顽疾,它不仅会对患者的言语、吞咽、咀嚼等功能造成严重危害,而且会导致下颌骨畸而形影响容貌,使患者的身体、心理健康遭受双重危害。长时间来,医务工作者们殚精竭虑针对TMJA的治疗采取过各种方法,然而却收效甚微。其主要原因是TMJA的发病机制尚未明确,颌面部肿瘤、外伤以及感染等多种因素均可导致TMJA,在诸多致病因素中创伤最为常见,由创伤引起的TMJA被称为创伤性TMJA。因此,对于创伤性TMJA发病机制的探究一直是近年来口腔颌面部领域研究的热点和难点。本课题组前期成功建立绵羊单侧颞下颌关节(TMJ)复合损伤造成创伤性颞下颌关节强直模型,并通过大体观察、影像学观察、组织学观察等方法得到翼外肌通过病理性牵张成骨的在创伤性TMJA中发挥着重要作用的结论。但颞下颌关节(TMJ)损伤是如何促使翼外肌发挥作用,又是如何造成创伤性TMJA的?其分子机制至今尚未明确。本研究将使用SD大鼠作为实验动物,在已有的研究基础上,通过建立颞下颌关节复合损伤大鼠模型,进一步对三叉神经运动核-翼外肌投射通路的解剖学进行研究,找到支配翼外肌的核团与翼外肌之间的作用关系,并探究三叉神经运动核-翼外肌投射通路在颞下颌关节复合损伤后的兴奋性变化。具体内容共包含以下三部分:实验一:颞下颌关节复合损伤大鼠模型的建立目的:通过对SD大鼠单侧髁突、关节盘、关节窝的复合损伤建立单侧颞下颌关节复合损伤模型。方法:以10只6周龄SD大鼠为实验动物,术前测量其最大主动开口度并记录。所有实验动物均在右侧颞下颌关节手术,模拟髁突骨折、摘除关节盘、关节囊并在关节窝上制造“十”字型损伤,左侧正常颞下颌关节作为对照。术后6周、12周分别对尚未死亡的实验动物进行最大主动开口度测量和活体Micro-CT扫描,观察术前术后最大开口度变化,髁突大小、形态变化,关节复合体中关节间隙及上、下关节面的变化。结果:与术前比较,术后6周、12周依然存活的实验动物的开口度均不同程度降低,均有统计学差异(P<0.001)。实验侧关节复合体受损明显,关节窝及髁突骨面粗糙不平,有钙化影像形成。与左侧正常髁突对比,实验侧髁突畸形膨大,髁突颈部宽度明显大于左侧正常髁突。实验侧关节间隙内可以见少量不连续新骨形成(P<0.001)。结论:颞下颌关节复合损伤大鼠模型初步建立成功。实验二:颞下颌关节复合损伤前后大鼠三叉神经运动核-翼外肌投射通路研究目的:通过对颞下颌关节复合损伤前后的SD大鼠翼外肌神经元进行逆标,找到颞下颌关节损伤前、后三叉神经运动核与翼外肌之间的神经元投射关系。方法:以6只8周龄SD大鼠为实验动物,随机平均分为2组,实验组按实验一方法均建立左侧颞下颌关节复合损伤大鼠模型,对照组大鼠颞下颌关节不做任何处理,再分别对2组SD大鼠左侧翼外肌注射逆行神经示踪剂—荧光金(Fluorogold,FG),注射1周后对动物进行灌注固定、取脑,经过后固定、沉糖、冰冻切片,对标本进行免疫荧光双标,在荧光显微镜和共聚焦显微镜下观察FG逆标神经元在Vmo内的标记情况和定位分布。结果:在荧光显微镜下,实验组和对照组在翼外肌注射FG的SD大鼠,在整个三叉神经运动核,包括其背外侧部(支配闭口肌)和的腹内侧部(支配开口肌)均可观察到FG逆标的神经元胞体。在共聚焦显微镜下免疫荧光双标显示FG标记的大部分Vmo神经元的中枢突终末同时也表现为NeuN免疫阳性,而且几乎所有FG和NeuN标记的神经元的胞体和树突接触紧密。结论:在颞下颌关节复合损伤前后,翼外肌均受三叉神经运动核(Vmo)调控,既参加开口运动,又参加闭口运动。实验三:三叉神经运动核-翼外肌投射通路在颞下颌关节复合损伤愈合过程中的作用研究目的:通过对颞下颌关节复合损伤后不同时间段SD大鼠支配翼外肌的三叉神经运动核(Vmo)内I型囊泡膜谷氨酸转运体(VGLUT1)和翼外肌内乙酰胆碱酯酶(AChE)的表达情况分析,明确三叉神经运动核(Vmo)神经元对于翼外肌神经元的兴奋性作用。方法:以20只健康SD大鼠为实验动物,术前随机分均为4组,每组5只,第1组为空白对照组,第2、3、4组手术制作左侧颞下颌关节复合创伤模型,大鼠分别饲养1周、2周、4周后分别取左侧三叉神经运动核和翼外肌,通过Western blot方法进行VGLUT1和AChE的蛋白质定量分析。结果:第2、3、4组三叉神经运动核中的VGLUT1浓度分别为1.20±0.38mg/ml、1.37±0.62mg/ml、1.46±0.69mg/ml,均较第1组1.00mg/ml明显升高(P<0.001),第2、3、4组翼外肌中的乙酰胆碱酯酶(AChE)浓度分别为1.09±0.10 mg/ml、1.30±0.10 mg/ml、1.30±0.21mg/ml,第2、3组较第1组1.00mg/ml明显升高(P<0.001)。结论:在颞下颌关节复合损伤发生后,三叉神经运动核(Vmo)与翼外肌的神经元兴奋性均有增强,且二者与时间大致呈正相关。