磷脂酰胆碱(PC)作为膜磷脂的一种组份与其它磷脂、膜蛋白以及其它成分相互作用共同组成细菌的膜系统,维持细菌在特定条件下的生理代谢和行使其特定的生物学功能。膜磷脂中PC含量的增加或减少必将改变细胞膜的生理生化特性,直接或间接地影响细胞膜、细胞膜外层分子乃至整个细胞的生物学功能。细胞膜中PC缺失或掺入还有可能影响贯穿细菌内膜和外膜的Ⅲ型分泌系统的功能,也有可能影响毒性蛋白的合成和转运。因此,本实验通过构建Pseudomonas pcs-菌株,克隆、表达、纯化毒性蛋白基因hrpz,并制备多克隆抗体,以检测PC的缺失对毒性蛋白hrpz在细菌体内的表达和分泌是否具有影响。从而进一步说明细菌细胞膜PC的合成对细菌致病力的影响。　　 本实验利用Blast搜索GenBank上所有已经报道的假单胞杆菌Pseudomonas磷脂酰胆碱合酶(pcs)基因,进行序列比对,找出pcs基因同源性比较高的保守区域,并设计简并引物,以实验室在土壤中筛选到的Pseudomonas593总DNA为模板,PCR扩增出Pseudomonas593 pcs基因的核心DNA序列,并以这段DNA序列为探针,通过Southern杂交的方法克隆出该菌pcs的整个基因序列。通过亚克隆将克隆的pcs基因插入到表达载体pET23a上,转化到细菌宿主细胞BL21(DE3)plysS中进行基因活性分析。结果显示克隆到的pcs基因具有生物活性。然后利用同源重组的方法将Pseudomonas593基因组DNA上的pcs基因敲除掉,构建得到pcs缺陷菌株Pseudomonas593pcs-,Pseudomonas593菌株在加有1％胆碱的LA培养基中生长时能有效合成磷脂酰胆碱(PC),而Pseudomonas593pcsg-不能。在相同条件下比较两种菌株在不同Na+离子浓度,SDS浓度,triton X-100浓度,CTAB浓度下的生长状况。结果发现两种菌对Na+离子的耐受性几乎相当,当Na+离子浓度小于2％时两种菌都能较好的生长,而当Na+离子浓度大于2％时两种菌都很难生长。在对不同去垢剂的耐受性性上,Pseudomonas593pcs-比Pseudomonas593都要强。　　 Hrpz蛋白作为假单胞杆菌主要的毒性蛋白,在假单胞杆菌的植物致病性上起着重要的作用。根据已经报道的丁香假单胞菌丁香致病变种(Pseudomonas syringae pv.Syringae Van Hall)的Hrpz基因序列设计引物,以丁香假单胞菌丁香致病变种的基因组DNA为模板,PCR扩增去终止密码子的Hrpz基因全长,插入到表达载体pET23a上,转化到细菌宿主细胞BL21(DE3)plysS中进行表达,并采用亲和层析的方法纯化出hrpz蛋白,从1L细菌培养物中可纯化出14mg蛋白。然后将纯蛋白免疫兔子,制备多克隆抗体。并构建能稳定表达hrpz的载体pUC19-hrpz-tetr-GFP,分别电转化入Pseudomonas593,Pseudomonas593 pcs-。