【摘 要】
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巴尔通体（Bartonlla）是一种胞内寄生、兼性厌氧的革兰氏阴性菌。巴尔通体以吸血节肢动物为传播媒介,通过叮咬导致感染的宿主产生持续性菌血症、猫抓病、心内膜炎等疾病,并在免疫低下人群中引发杆菌样血管瘤及杆菌样紫癜等疾病。巴尔通体通过其Vir B/Vir D4四型分泌系统分泌效应蛋白至宿主细胞内,调控宿主细胞凋亡、骨架重排及炎性反应。其中效应蛋白BepE能促进宿主的树突状细胞迁移,使巴尔通体能挟持
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巴尔通体（Bartonlla）是一种胞内寄生、兼性厌氧的革兰氏阴性菌。巴尔通体以吸血节肢动物为传播媒介,通过叮咬导致感染的宿主产生持续性菌血症、猫抓病、心内膜炎等疾病,并在免疫低下人群中引发杆菌样血管瘤及杆菌样紫癜等疾病。巴尔通体通过其Vir B/Vir D4四型分泌系统分泌效应蛋白至宿主细胞内,调控宿主细胞凋亡、骨架重排及炎性反应。其中效应蛋白BepE能促进宿主的树突状细胞迁移,使巴尔通体能挟持树突状细胞作为“木马”,加速其体内感染扩散。鉴于巴尔通体感染血管内皮细胞形成血管瘤,因此我们将在本论文中对BepE与血管内皮细胞迁移的相关性开展探索研究。本研究利用SacB介导的同源重组技术成功构建了汉塞巴尔通体（Bhe）效应蛋白BepE的缺失突变菌株Bhe-?BepE以及回补表达菌株Bhe-pBepE。首先扩增BepE基因的上下游同源片段,将片段导入自杀性质粒pJM05,构建敲除质粒pJM05-?BepE。通过S17-1与Bhe的接合转移,将pJM05-?BepE重组质粒导入到Bhe基因组中,再利用SacB基因的筛选及菌落PCR鉴定出BepE缺失突变株Bhe-?BepE。扩增BepE全长基因,导入到回补表达质粒p ANT4中。通过S17-1与Bhe-?BepE的接合转移,将p ANT4-BepE回补质粒导入到Bhe-?BepE中,构建回补表达菌株Bhe-pBepE。将Bhe、Bhe-?BepE与Bhe-pBepE分别感染血管内皮细胞（HUVECs）,24 h后进行细胞划痕实验。在0 h、6 h、12 h与18 h对划痕区域进行定点拍摄,通过计算细胞迁移率比较三种菌感染后的HUVECs迁移能力。结果显示,三种菌感染后的HUVECs迁移能力并无显著区别,即Bhe效应蛋白BepE并没有促进血管内皮细胞迁移的作用。随后我们将包被Bhe-BepE基因的慢病毒感染HUVECs,并通过迁移小室进一步探索BepE对HUVECs的迁移能力的影响。结果显示表达Bhe-BepE的HUVECs与对照组细胞相比,迁移能力并无显著差异。这说明BepE自身并不能直接促进HUVECs的迁移。此外我们分别用黏着斑蛋白Vinculin与桩蛋白Paxillin的抗体免疫标记细胞黏着斑,结果发现表达Bhe-BepE的细胞黏着斑数量明显低于e GFP对照组,BepE表达区域形成细胞皱褶,黏着斑去组装过程显著加快。综上,本研究证实巴尔通体的效应蛋白BepE自身无法促进血管内皮细胞迁移,但可以有效促进细胞黏着斑的去组装,提示BepE需要与其它效应蛋白合作产生协同效应,利用其它效应蛋白促细胞收缩能力及其自身的促黏着斑去组装能力,从而促进细胞迁移。本论文为深入研究BepE在细胞迁移过程中的作用机制提供了参考。
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