一、研究背景和目的尿路感染(urinary tract infection, UTI),简称尿感,是指病原体侵入尿路粘膜或组织引起的尿路炎症。根据感染部位,尿路感染可分为下尿路感染和上尿路感染,前者主要为膀胱炎,后者为肾盂肾炎,肾盂肾炎又可分为急性和慢性。根据Hodson标准,急性肾盂肾炎是细菌入侵肾脏,引起急性间质肾小管炎；而慢性肾盂肾炎,又有静脉肾盂造影典型肾盂肾炎的影像学表现。根据有无基础疾病,尿路感染还可分为复杂性尿感和非复杂性尿感。UTIs可以发生在任何年龄,男性的发病率约为0.3%,而在65岁以后,由于前列腺疾病和泌尿外科手术,其发病迅速增加到13%-14%。由于女性的特殊生理构造,女性比男性更易感,据统计,大约有81%的UTIs发生在女性,年龄在16到35岁之间,其中27%女性在初次尿路感染后半年内复发,约有48%的女性一年内受到UTIs复发的困扰。尿路感染是临床最为常见的细菌感染之一,目前治疗主要以使用抗生素为主,由于致病菌临床的耐药性越来越强,使其容易反复发作。反复发作的尿路感染不仅使病人遭受痛苦也在全球造成很大的医疗和经济负担。大部分尿路致病菌都起源于肠道,经尿道上行至膀胱。约95%的UTIs的起始感染部位是膀胱,在尿路感染中,由尿路致病性大肠杆菌(Uropathogenic Escherichia coli, UPEC)引起的UTIs占80%-90%。目前主要的研究工作是围绕UPEC展开的。绝大多数UPEC都携带ompT基因,其编码的外膜蛋白T(outer membrane protein T, OmpT)是一种在变性溶液中都具有很强活性的蛋白水解酶,因其引起外源表达蛋白的严重降解而引起关注。OmpT作为一种多活性蛋白酶,它是引起外源充足蛋白降解的重要的蛋白水解酶之一,在尿路感染中有重要的作用。其底物及切割位点的不同均可引起其作用活性的改变,OmpT主要识别水解由碱性氨基酸Arg和Lys残基组成的肽键。研究发现OmpT与鼠耶尔森杆菌Pla有47%同源的性。有研究证明Pla可以增强细菌黏附到细胞外基质并可以激活纤溶酶原转换为纤溶酶,促进细胞外基质的降解而致病的功能。OmpT是否也具有与细胞外基质相互作用影响尿路致病性大肠杆菌的黏附侵袭而致病呢?本课题中,我们利用本实验室前期构建的尿路致病性大肠杆菌CFT073的ompT基因敲除株和回补株COTD(pST),进行一系列实验研究。我们对ompT野生株CFT073和敲除株COTD对体外细胞模型和对细胞外基质的黏附情况进行考察。通过建立人膀胱癌移行上皮细胞5637细胞模型,并提取细胞外基质,考察OmpT与细胞外基质相互作用的情况。结果发现与野生株CFT073相比敲除株COTD的黏附率明显降低,推测OmpT可能会增强致病菌对细胞外基质的黏附能力,为后续的降解细胞外基质,促进细菌进入胞内打下基础。流行病学分析表明,多数UPEC中的ompT与kpsMT、cnfl、sfa、prf、iha、 iroN等基因密切相关,研究表明ompT与这些毒力基因在遗传学上并非紧密连接,推测其功能与这些毒力基因的相互调控相关[4]。由于基因的表达调控不是单一的、孤立的,而是彼此联系,相互制约的,构成了复杂的基因表达调控网络。几乎所有的细胞活动和功能都受基因网络调控,独立的研究单个基因及其表达几乎完全不可能确切的反应生命现象本身和内在规律。所以我们在本研究中通过荧光定量PCR方法分析ompT基因与细菌主要黏附毒力基因iha和毒力基因iroN的关系,明确OmpT是否在调控毒力基因的表达中起到一定的作用。同时我们通过建立小鼠急性尿路感染的动物模型,比较野生株CFT073与ompT基因缺失株COTD所致尿路感染小鼠的泌尿器官的病理改变的差异,比较产生菌血症的差异和膀胱和肾脏组织中的细菌组织载量的不同,考察OmpT在致炎过程中的作用。其次,我们采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunoadsordent assay, ELISA)和免疫组织化学的方法比较缺失ompT基因后,小鼠急性尿路感染模型中泌尿系统重要脏器和血浆中的IL-6, IL-8的表达。本课题的目的在于初步研究OmpT在尿路致病性大肠杆菌的致病中所起到的作用。二、研究方法1. OmpT与细胞外基质相互作用对细菌黏附侵袭的影响通过将细胞外基质和细胞共同作用以后,检测有无细胞外基质,细菌对细胞的黏附侵袭率的变化,探讨OmpT与细胞外基质的相互作用以及对细菌的黏附侵袭的影响。采用去细胞化方法进行体外细胞外基质的提取,在去细胞化的培养皿上接种人膀胱癌上皮细胞5637细胞,检测细菌对其的黏附侵袭,同时在没有预铺板的平皿做常规细菌黏附侵袭实验,比较OmpT对细胞外基质的黏附情况。利用BD公司的细胞基质胶进行细菌的黏附实验。将购买的商品化小鼠来源的基底膜基质胶按照说明书用预冷的1×PBS中稀释25倍,吸取250μL稀释好的基质胶于8孔腔室玻片中,37℃孵育2.5h后加入含有2%BSA-PBS室温淬灭1h。将CFT073、COTD及COTD(pST)活化后用0.1%BSA的PBS将菌液调整为1×107～1×108/mL,吸取300μL于腔室玻片中室温孵育3h。对照组加入250μL200μg/mL的BSA。3h后用0.1%的BSA-PBS轻柔冲洗3次后,显微镜下直接观察结果。2. OmpT对编码细菌黏附素iha基因及编码转铁蛋白iroN基因表达的影响通过荧光定量PCR方法检测OmpT对编码黏附素iha和转铁蛋白iroN基因的表达的影响。采用Trizol法提取CFT073、COTD、COTD(pST)的总RNA,采用两步法进行RT-PCR反应,将总RNA逆转录为cDNA,以16s-rRNA为内参基因,以cDNA为模版进行SYBR-Green染料法,进行荧光定量PCR反应,经对Ct值换算得出基因的相对表达量,进行比较。3. OmpT对尿路感染小鼠的致炎作用为观察OmpT对尿路感染小鼠的致炎作用,我们选择7周龄SPF级C57BL/6雌性小鼠进行尿路插管膀胱灌注细菌建立小鼠急性尿路感染模型。小鼠菌液灌注12h后,取小鼠膀胱和肾脏组织进行HE染色,显微镜下观察小鼠急性尿路感染后膀胱和肾脏的病理改变。心脏取血样,稀释涂板计数,进行菌血症的检测。取膀胱和肾脏组织进行细菌组织载量的检测。4. OmpT对尿路感染小鼠体内细胞因子表达的影响采用酶联免疫法和免疫组织化学法检测IL-6和IL-8的表达。小鼠造模12h后,取出小鼠肾脏和膀胱,用PBS进行冲洗三遍洗净脏器表面的血迹,放入匀浆器中,加入1mL的PBS进行匀浆,再将匀浆液离心取上清作为细胞因子的检测的标本,血液标本是离心取血浆进行检测。膀胱和肾脏组织经4%多聚甲醛固定后,常规石蜡包埋切片,免疫组化SP法进行检测和比较尿路感染小鼠组织中的IL-6和IL-8蛋白的表达。三、结果1. OmpT与细胞外基质相互作用影响细菌黏附侵袭计算CFT073、COTD和COTD(pST)三组细菌对细胞5637的黏附率,分析结果显,CFT073黏附率为8.81±1.13%,COTD为4.62±39%,COTD(pST)为5.81±0.69%,χ2=21.316,P<0.05三种菌株的黏附率有显著差异,敲除株粘附率低于野生株。计算三组细菌对ECM预铺板的5637细胞的黏附率,发现CFT073黏附率为8.85±0.79%,COTD为4.95±0.59%,COTD(pST)为6.23±0.32%,三种菌株的黏附率有显著差异(χ2=23.150,P<0.05),敲除株COTD黏附率显著低于CFT073和COTD(pST),与没有ECM预铺板的5637细胞的黏附率相比,细菌粘附率升高不明显。镜下观察细菌与ECM的作用结果发现,与对照组相比,黏附到预铺板小皿的细菌明显较多；敲除株的细菌黏附数明显少于野生株和回补株。2. OmpT影响黏附素Iha和转铁蛋白IroN的mRNA表达为探索OmpT是否经对参与调节黏附素Iha和转铁蛋白IroN的调节,16s-rRNA为内参基因,采用荧光定量PCR方法进行检测。荧光定量数据进行经log换算后发现,iha基因在ompT基因敲除株中的表达量(1-0.04)明显低于野生株的表达量(2.03-0.07),在回补株中的表达量回升到1.56-0.05；iroN基因在ompT基因敲除株中的表达量(1±0.10)明显低于野生株的表达量(3.82±0.07),回补株中的表达量回升到2.49-0.04。因此我们推测,OmpT可能上调了基因iha和iroN的表达。3. OmpT增强尿路感染小鼠炎症反应通过对尿路感染小鼠的膀胱和肾脏组织HE染色。观察发现在膀胱组织中,可见野生株感染的小鼠膀胱组织中性粒细胞成片增多、粘膜脱落明显,而ompT敲除株感染的小鼠膀胱组织中的炎症细胞明显少于野生株,粘膜脱落不明显。在野生株感染的小鼠肾脏组织中,可见明显炎症反应,如肾小球集中,中性粒细胞显著增多,敲除株感染的小鼠肾脏病理改变不明显,肾小球未出现明显集中,中性粒细胞较野生株感染小鼠相比,明显减少。根据菌落计数计算细菌所致菌血症程度,经log转换以后,野生株模型中血液中的平均菌落数2.52±0.05cfu/mL,敲除株的为2.01-0.02cfu/mL。结果分析显示,野生株的菌血症程度高于敲除株(F=209.09,P<0.05)。经对数转换后野生株在小鼠膀胱组织中的载量均数为6.36±0.06,而敲除株为6.01±0.07,回补株6.29-0.06,分析结果显示各组差异有统计学意义(F=53.54,P<0.05)。细菌在肾脏组织中的载量,野生株为6.25±0.05,敲除株为5.87-0.06,分析结果显示F=65.26,P<0.05,组间差异有统计学意义,敲除基因ompT以后,细菌在膀胱和肾脏的组织载量明显降低。4. OmpT增强尿路感染小鼠体内细胞因子的表达通过建立小鼠尿路感染模型,检测尿路感染小鼠的膀胱、肾脏和血液中的IL-6和IL-8的表达,经分析可以看出灌注敲除株COTD组别的小鼠血浆、膀胱和肾脏组织中IL-6和IL-8的含量明显低于野生株和回补株组。通过析因方差分析组织中IL-6和IL-8的含量数据,结果显示,野生株、敲除株和回补株组间有显著性差异(F=272.51,P<0.001),处理组与细胞因子的含量有交互效应,分析交互作用(F=18.42,P<0.001),提示OmpT影响IL-6和IL-8在膀胱组织、肾脏组织和血液中的表达。四、统计学分析本文所涉及统计内容均应用SPSS13.0统计软件进行处理。数据均表示为均数±标准差。两样本计量资料的比较,方差齐时使用两独立样本t检验(Independent-Samples T test),方差不齐时应用t’检验(Separate Variance Estimation t-test)进行分析。率的比较采用非参数检验。多样本计量资料的分析使用单向方差分析(One Way-ANOVA),进行后续两两比较时,方差齐采用LSD法,方差不齐时采用Dunnet T3法。等级资料的分析采用非参数检验中的K-independent Samples Tests。P<0.05表示差异具有统计学意义。五、结论1.OmpT通过与细胞外基质相互作用影响细菌对宿主细胞的黏附和侵袭作用。2. OmpT可能通过调节黏附基因iha和转铁蛋白基因iroN的表达,从而发挥网络调控的作用,影响细菌的致病。3. OmpT可能通过影响尿路致病大肠杆菌在体内引发的炎症反应和细胞因子的表达而在致病中发挥作用。