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CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Regulatory T Cellls,Treg)是天然产生的调节性T细胞的重要亚群之一,在维持免疫系统稳态中发挥重要的作用。近年来越来越多的证据证明,CD4+CD25+调节性T细胞在维持机体内环境的稳定、肿瘤免疫监测及自身免疫性疾病的发生中均发挥重要作用。但是机体内天然的Treg细胞数目很少,在人体内,Treg细胞占CD4+T细胞的5%～10%,而小鼠的只占1%～2%。因此,必须建立有效的Treg细胞体外扩增方法,才能满足大量的临床输注需要。目前,普遍利用anti-CD3、CD28单克隆抗体和外源IL-2体外扩增Treg细胞,但其扩增效率很低,不能满足临床需求。此外,通过与DC的共培养也能达到扩增Treg细胞的效果。Treg细胞不仅在胸腺中产生,也可以在外周诱导生成。研究表明,TGF-β在Foxp3+诱导型Treg细胞(induced Treg,iTreg)的诱导、扩增和抑制功能中发挥了重要作用。本实验应用免疫磁珠分离纯化C57BL/6小鼠的CD4+CD25+T细胞,采用同基因及异基因不同种类的DC在体外扩增Treg细胞,通过流式细胞术和T细胞增殖抑制实验检测扩增前后Treg细胞表型和功能。此外,本实验采用TGF-β、IL-2和anti-CD3/CD28单克隆抗体诱导生成iTreg细胞,并验证其表型和功能。实验结果发现,MACS分离的CD4+CD25+调节性T细胞纯度达到93.57%,同基因和异基因DC都能有效刺激Treg细胞体外扩增,其中同基因成熟DC扩增效果最为明显。同基因成熟DC扩增后CD4+CD25+调节性T细胞纯度达到94.16%,且高表达Foxp3分子。当CD4+CD25+调节性T细胞与效应T细胞比例为1∶1时,能够有效的抑制效应T细胞的增殖,而且,同基因成熟DC扩增的CD4+CD25+调节性T细胞的抑制效果比新分离的Treg效果更好。由此可见,同基因成熟DC能够体外扩增表型和功能稳定的Treg细胞。MACS分离纯化的小鼠CD4+CD25-T细胞低表达Foxp3分子,为17.62%,与Treg细胞功能相关的分子CTLA-4和CD62L表达也比较低,分别为1.37%和73.61%。经TGF-β、IL-2和anti-CD3/CD28单克隆抗体体外诱导5天后,其Foxp3的表达上调至98.70%,而且其功能性分子CTLA-4和CD62L的表达也分别达到72.1%和87.51%。T细胞增殖抑制实验结果表明,iTreg细胞与效应T细胞比例为0.5∶1和1∶1时,能够有效的抑制T细胞的增殖。同时,本实验利用不同树突状细胞体外扩增iTreg细胞,结果显示,同基因和异基因DC都能够扩增iTreg细胞,其中异基因调节性DC扩增效果最为明显。本研究为今后Treg细胞应用于诱导同种异基因移植耐受以及自身免疫性疾病治疗等临床应用提供实验依据和新的途径。