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细胞色P450单加氧酶系是一类广泛分布于生物有机体中的重要酶系,P450酶曾被称为多功能氧化酶（MFO）、单加氧酶（monooxygenase）、芳香烃羟化酶和药物代谢酶等多种名称。它能够代谢多种内源性物质和外源性物质,细胞色素P450酶系不仅涉及一系列内源性物质如保幼激素及其类似物、蜕皮甾醇和生物信息素的代谢,也涉及对外源性物质如杀虫剂、植物次生物质和环境污染物等多种化合物的代谢,因其生物学的重要性,一直是生物学领域研究的一个重要对象。为了在分子水平上研究家蚕胞色素P450基因的特性,更好地探讨其与抗性相关机制,本研究就家蚕细胞色素P450基因的克隆及异源表达开展了研究,主要研究结果如下:1.选定克隆序列从NCBI下载果蝇（Drosophila melanogaster）、冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）等多种昆虫P450s蛋白质序列,和西南大学家蚕基因组数据中所预测的家蚕基因蛋白质序列进行BLAST P比对,其E-valve≤1e-7,得到66条含有血红素结合标志性位点（P450 Signature）FxxGxxxCxG的P450基因序列,选择了主要与抗性相关的CYP3集团（clan）中具有完全编码框的基因（并含有P450基因特征结构域）的1条序列,据此设计引物。经过PCR扩增得到一条长度约为1,470 bp的目的条带。2.采用T-A克隆法对该基因序列进行了克隆测序结果表明,该基因ORF为1,470 bp,编码489个氨基酸,Expasy网站预测蛋白质分子质量为56.60 KDa,符合一般P450s的分子量为46～60 KDa的规律,等电点为8.64。用Sim4程序,将该基因核酸序列与家蚕基因组序列相比较发现只含有1个内含子,大小为1,903 bp,外显子和内含子边界处符合GT-AG规则。在推定的氨基酸序列中包含所有昆虫P450基因的5个特征序列,即:P450基因标志性的FxxGxxxCxG（428-437）血红素结合位点的共有序列;位于螺旋C中与血红素结合有关的保守序列WxxxR（116-120）;位于螺旋I中P450氧结合部位的AGxE/DT（295-299）保守序列;位于螺旋K中参与稳定核心结构的ExxR（353-356）完全保守序列;以及特征序列‘PERF’的PxxFxPE/DRT（404-412）。经蛋白质结构分析发现其N端包含有一条高度疏水性的信号肽序列,22个氨基酸中含有15个疏水氨基酸。3.和其它已测序的家蚕P450基因的同源性分析从NCBI下载已测序登陆的26个家蚕细胞色素P450基因的氨基酸序列,根据MEGA 3.1程序,运用近邻法（NJ,neighbor joining）建立系统发育树,得出该基因和以代谢异生物质为主的CYP6和CYP9家族基因的同源关系较近,和以代谢内源物质为主的CYP4家族基因的同源关系较远,而和以合成与代谢昆虫体内蜕皮激素、保幼激素等为主的其他家族基因的同源关系则更远。4.和其它家族成员的同源性分析在NCBI进行BLAST P在线同源性比对,发现美国棉铃虫CYP321A1和邪恶按蚊CYP6P9的同源性相对较高,分别为34%、32%,均低于40%。根据规则,被国际细胞色素P450委员会命名为新家族的第一个基因CYP337A1（GenBank登陆号:EF415297）。下载同源性较高,且具有代表性的其它家族成员的序列,利用ClustalX 1.83进行氨基酸相似性的聚类分析。CYP337A1具有CYP6等家族基因拥有的血红素保守结合区PFxxGxRxCxG,但在CYP6家族基因高度保守的ETLR序列及PERF序列中均发生了一定变异,它和已经与CYP6家族基因趋异分离的CYP321A1同源性相对最高。5.原核表达以pET50（b）为表达载体,将CYP337A1基因的编码区亚克隆至pET50（b）构建重组表达质粒,转化至BL21细胞,挑取单克隆用TB培养基在37℃进行培养并用1 mmol/L IPTG诱导表达该基因的蛋白质。同时以转化有pET50（b）空载体的同时诱导作为对照。经SDS-PAGE电泳在120 KDa左右得到特异目的蛋白带,pET50（b）表达载体中Nus.Tag标签是64.3 KDa,而表达产物的蛋白分子量在56.60 KDa左右,所以,与His的融合蛋白的分子量是120 KDa。实验结果与预期一致,说明该基因编码的蛋白得到了表达。6.表达条件优化进一步利用不同条件对含重组质粒的菌液进行诱导,发现融合蛋白在温度为32℃～37℃,IPTG浓度为0.6 mmol/L时,诱导2 h左右,蛋白表达量最大。该实验为利用该基因的蛋白产物进行功能分析创造了条件。