【摘 要】
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红花草莓(Red-flowered strawberry)为属间杂种,其红花性状是由开红花的沼委陵菜(Potentilla palustris)与开白花的栽培草莓(Fragaria×ananassa)通过远缘杂交的方式获得的。由于红花草莓花瓣中谷胱甘肽转移酶(Glutathione S-Transferase,GST)在花青苷积累方面的作用尚不明确,本研究以课题组自育的红花草莓品种红色的‘四季红’
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红花草莓(Red-flowered strawberry)为属间杂种,其红花性状是由开红花的沼委陵菜(Potentilla palustris)与开白花的栽培草莓(Fragaria×ananassa)通过远缘杂交的方式获得的。由于红花草莓花瓣中谷胱甘肽转移酶(Glutathione S-Transferase,GST)在花青苷积累方面的作用尚不明确,本研究以课题组自育的红花草莓品种红色的‘四季红’、粉色的‘SF14’和白色的‘B1’作为试材,通过红花草莓转录组数据及生物信息学分析进行功能性基因的筛选。利用基因克隆、亚细胞定位、分子对接技术及启动子克隆等方法,首次解析了红花草莓花瓣花青苷转运与GST基因的相关性,探讨了红花草莓花瓣花青苷积累的机理。主要结果如下:(1)以二倍体森林草莓基因组为参考,通过与拟南芥GST基因序列比对,在森林草莓中共筛选得到66个GST基因成员,通过与拟南芥已知功能的GSTs构建系统发育树。将66个森林草莓FvGST基因分为7个亚家族,其中Tau类亚家族的成员最多,42个;Phi类有7个基因,可能参与花青苷的转运。FvGST基因家族在7条染色体上呈现不均匀分布,出现了大量的串联重复事件,各个类别的家族成员在保守基序与结构域上的种类、数量和结构形式上表现出一定的相似性。根据红花草莓转录组数据,进行差异基因表达分析,发现7个Phi类基因在红花草莓花瓣中仅3个差异表达,分别命名为FpGST1、FpGST2和FpGST3。(2)对筛选得到的三个基因进行实时荧光定量试验,结果显示,FpGST1、FpGST2和FpGST3在花瓣上均特异性表达。三个基因的表达量在粉色、红色花瓣的数值都高于白色花。在花发育不同时期(从蕾期、转色期到大蕾期),随着花瓣颜色加深,表达量呈现递增的趋势。因此推测,FpGST1、FpGST2和FpGST3基因可能均参与花青苷的转运。(3)从红花草莓‘四季红’盛花期花瓣和B1盛花期花瓣中克隆得到完整的的编码区序列。通过对红白花色间氨基酸序列进行比对,FpGST1和FpGST2在两个花色间没有差异,FpGST3存在一个密码子的差异。通过亚细胞定位结果显示,三个基因均可定位到谷胱甘肽转移酶与花青素苷结合的位置内质网膜以及细胞核上。(4)对三个基因的启动子进行克隆,序列比对发现Q-FpGST3在红、白花中克隆结果基本一致,Q-FpGST1仅有一个碱基的差异,而Q-FpGST2存在花色间的差异。通过可视化分析显示,三个基因受多种顺式作用元件和反式作用因子的相互协调作用,三个启动子中TATA-box作为-30左右的开始转录的核心启动子元件数目最多;CAAT-box作为共同的顺式作用元件在启动子和增强子区域,数量也偏高。三个启动子都包含基本作用元件,而且都分别有一个MYB转录因子的黄酮类化合物结合位点。(5)通过对三个基因的蛋白质三维结构分析发现它们有一定的相似性,且建模结果相近,都与毛果杨谷胱甘肽转移酶晶体相近,覆盖率超过50%。将三个基因分别与矢车菊素和天竺葵素进行分子对接。分子对接数据表明三个基因同源性高,均能够与花青苷共价结合,其中FpGST2与两种花青苷结合程度相近,而FpGST1与花瓣中主要的花青苷矢车菊素的结合效果更好,FpGST3与果实中主要的花青苷天竺葵素结合效果更好。
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