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2甲4氯(MCPA)是一种典型的苯氧羧酸类除草剂,在农业生产上常用于阔叶杂草和部分莎草的防治。2甲4氯大量、频繁地使用造成土壤残留污染,危害生态环境,威胁农产品安全和人体健康。微生物降解是土壤农药污染修复的重要方式。本文以一株2甲4氯高效降解菌Cupriavidus gilardii T1为研究对象,对其进行增强绿色荧光蛋白(EGFP)标记,探究降解2甲4氯的质粒pDOM在土壤中发生水平转移的制约因子,明确质粒pDOM供体菌在室内重复施药和田间试验中对土壤2甲4氯的降解趋势;通过荧光定量PCR对2甲4氯降解基因tfd A进行定量,分析重复施药处理后土壤中2甲4氯降解基因tfd A拷贝数的变化趋势;利用通用引物扩增土壤细菌16S r RNA和真菌ITS基因序列,采用Illumina高通量平台测序、分析室内重复处理和田间强化修复后,2甲4氯和质粒pDOM供体菌对土壤微生物群落结构和功能多样性的影响。主要研究结果如下:(1)利用菌株C.gilardii T1(pDOM)、E.coli DH5α(p TR-EGFP)及E.coli DH5α(p RK2013)的交叉抗性进行三亲杂交构建EGFP标记的质粒供体菌C.gilardii T1::p TR-EGFP。通过激光扫描共聚焦荧光观察、tfd A降解基因扩增和2甲4氯降解功能试验证明C.gilardii T1::p TR-EGFP构建成功。C.gilardii T1::p TR-EGFP与C.gilardii T1降解2甲4氯的能力基本相当。(2)在灭菌和非灭菌土壤中,质粒pDOM供体菌对2甲4氯的强化作用相当。菌株C.gilardii T1对2甲4氯的降解半衰期分别为3.65 d(非灭菌土)和4.33d(灭菌土);菌株C.gilardii T1::p TR-EGFP对2甲4氯的降解半衰期分别为2.87d(非灭菌土)和2.95 d(灭菌土)。(3)通过室内重复施药研究了EGFP标记的质粒pDOM供体菌对2甲4氯降解作用的持久性及其对土壤微生物群落结构的影响。第一、二、三和四次重复施药后,质粒pDOM供体菌降解2甲4氯的半衰期分别为2.20、3.01、2.67和4.25 d,降解基因tfd A拷贝数维持在3.33×10~6～1.60×10~7copies/g土之间;荧光观察显示,四次施药后的土壤样品中均能检测到大量的绿色荧光,表明质粒pDOM供体菌能够持续降解2甲4氯。在四次重复施用2甲4氯后,接种C.gilardii T1::p TR-EGFP可以降低2甲4氯对土壤细菌群落的潜在毒害作用,在一定程度上维持了土壤微生物群落结构的稳定。同时发现菌株C.gilardii T1::p TR-EGFP的生长及其对2甲4氯的降解作用可能受土壤中嗜甲基菌属(Methylotenera)微生物代谢过程的协同作用。(4)以合肥市郊区未耕作的农田土壤为供试土壤,将质粒供体菌C.gilardii T1::p TR-EGFP投加到土壤中,探究质粒pDOM强化降解2甲4氯的制约因子。结果表明:在初始接菌量为10~5、10~6和10~7CFU/g土的条件下,C.gilardii T1::p TR-EGFP降解2甲4氯的降解半衰期分别为6.30、1.87和1.10 d;C.gilardii T1::p TR-EGFP对土壤底物浓度为1、10和50 mg/kg 2甲4氯的降解半衰期分别为0.30、3.30和3.15 d;在不同培养温度和土壤含水量条件下,C.gilardii T1::p TR-EGFP对2甲4氯的降解速率大小为:30℃>35℃>25℃,50%WHC>40%WHC>30%WHC。不同影响因素下的土壤样品中均能检测到较强的绿色荧光。(5)通过田间试验探究了质粒pDOM供体菌对农田2甲4氯污染土壤的生物强化作用及其对土壤微生物群落结构的影响。3 d时菌剂C.gilardii T1处理对2甲4氯的降解速率达到最大(0.30 mg/(kg·d)),2 d时菌剂C.gilardii T1::p TR-EGFP处理对2甲4氯的降解速率达到最大(0.20 mg/(kg·d));菌剂施用45 d后,C.gilardii T1和C.gilardii T1::p TR-EGFP处理对2甲4氯的降解率分别为51.43%和48.19%。荧光观察显示,在接种质粒pDOM供体菌后0-45 d,土壤样品中均能检测到绿色荧光,表明质粒pDOM供体菌可以适应自然田间环境并且得以存活。土壤微生物16S r RNA和ITS扩增子测序结果表明:质粒pDOM供体菌能够在土壤中相对丰度不占优势情况下发挥较好的降解效果,质粒pDOM供体菌的施用不仅能有效修复2甲4氯土壤污染,还对使用2甲4氯导致土壤微生物群落结构改变有正向调控作用。