脊髓损伤不仅能造成运动和感觉的功能缺失,还会导致自主神经功能障碍,如排尿功能失调。在高级排尿中枢与脊髓之间的联系被切断后,排尿反射由于失去上位神经的调节,会暂时丧失反射活动的能力,膀胱和尿道括约肌也会进入无反应状态。失去上位神经支配后,在脊髓水平的神经塑形会导致非意识排尿反射的逐渐恢复,但仍远不能达到正常排尿的排空率,主要是因为失去高位调控引起的膀胱功能亢进、逼尿肌-括约肌失调等其他功能障碍造成尿液排空与贮存的困难。这些排尿障碍严重地影响了脊髓损伤患者的生活质量。目前,对于这种脊髓损伤后的排尿障碍仍没有有效的药物治疗方法问世,导尿术仍是唯一能有效排出尿液的手段。多巴胺在中枢神经系统中是一种非常重要的神经递质,具有广泛的生理功能调节作用。传统观念认为,多巴胺能神经元在中枢神经系统中只局限于脑内的某些区域里,而脊髓中的多巴胺则全部来源于脑中的多巴胺能神经元。然而,我们之前的研究在雌性大鼠的低位脊髓中也观察到了多巴胺能神经元的存在,并且在完全失去高位神经支配后,脊髓中的多巴胺浓度仍能维持在一定的水平上。我们同时还观察到在脊髓损伤后这些多巴胺能神经元发生了可塑性改变,并且能对排尿反射产生一定的调节作用。这些结果表明了脊髓内源性多巴胺信号的存在,以及其与排尿反射之间的联系。由于这些结果是基于雌性大鼠的研究,考虑到泌尿生殖系统在解剖和生理功能上存在的巨大性别差异,相同或相似的结果能否在雄性大鼠上得到仍有待进一步的研究。因此,本课题利用组织学和生理学功能检测技术,对脊髓内源性多巴胺能神经机制对脊髓损伤雄性大鼠排尿反射的调控进行了探究。本研究的结果将为脊髓损伤后排尿功能的恢复治疗提供新的理论基础和实验依据。第一部分雄性大鼠的脊髓内源性多巴胺能信号表达及脊髓损伤后的可塑性变化多巴胺合成于多巴胺能神经元内,这一过程需要两种关键酶的参与:酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)和多巴脱羧酶(dopamine decarboxylase,DDC)。TH可以催化L-酪氨酸转化为左旋多巴,DDC则继续将左旋多巴转化为多巴胺。多巴胺还作为去甲肾上腺素(noradrenaline,NA)前体参与NA在去甲肾上腺素能神经元中的合成,该过程由多巴胺-β-羟化酶催化(dopamine-β-hydroxylase,DBH)完成,所以多巴胺能神经元中不表达DBH。在很长一段时间里,多巴胺能神经元被普遍认为只局限于脑中的某些区域内,而脊髓中的多巴胺来源于脑中的A11细胞群。然而有研究表明在大鼠的脊髓腰骶部中有TH阳性细胞的存在,而我们之前的研究结果则在雌性大鼠中证实了这些TH阳性细胞就是多巴胺能神经元,并且也观察到了脊髓损伤后多巴胺能神经元的可塑性变化。但这些结果是否在雄性大鼠中也成立还有待进一步的研究。基于以上背景,本课题采用了免疫荧光共染技术对脊髓切片进行染色,以显示多巴胺能神经元在脊髓中的分布情况,同时采用快速扫描循环伏安法(fast scan cyclic voltammetry,FSCV)对脊髓中的多巴胺释放进行了检测。研究结果表明,不论是在正常的还是脊髓损伤后的雄性大鼠中,TH阳性细胞都存在于腰骶部脊髓的灰质中,并且其大部分位于L6至S3脊髓节段。横截面切片的染色结果显示TH阳性细胞主要分布于副交感节前神经元富集的脊髓灰质侧角及脊髓背角浅层区域,提示了其与自主神经功能以及感觉传入间的联系。没有TH阳性细胞显示DBH共染,说明了这些细胞不是去甲肾上腺素能神经元而是多巴胺能神经元。同时我们也观察到了在脊髓损伤后这些TH阳性细胞的可塑性变化。相比于正常大鼠,胸髓横断后腰骶部脊髓内TH阳性细胞数逐渐增多。FSCV实验也在腰骶部脊髓切片的副交感神经节前神经元核团区域检测到了多巴胺的释放,甚至在脊髓损伤后7周时多巴胺的释放仍保持在一定的水平。所有这些实验结果表明,多巴胺能神经元确实在雄性大鼠的脊髓中存在,并且脊髓损伤可以诱导其可塑性的改变。其在脊髓中的分布位置也提示了其与参与排尿功能调节的可能性。第二部分药物调控脊髓内源性多巴胺信号对脊髓损伤雄性大鼠排尿反射的作用中枢神经系统多巴胺信号对排尿功能具有调节作用,多巴胺信号失调常常会导致排尿功能障碍。其调节作用在生理状态下主要是通过作用于脑桥排尿中枢(pontine micturition center,PMC)的多巴胺受体而实现的,且不同的多巴胺受体亚型可以介导不同的调节作用。有研究显示多巴胺受体在低位脊髓中也有表达,提示多巴胺可能在脊髓水平也能发挥协助调节排尿功能的作用。在雌性大鼠上的研究也证实了脊髓中的多巴胺信号参与对脊髓损伤后部分恢复的排尿反射的调节。在上一部分的研究中我们已证实多巴胺神经元和多巴胺信号释放在雄性大鼠脊髓中确实存在,可以猜想脊髓多巴胺信号通路在雄性大鼠上也可能会发挥与在雌性大鼠上类似的调节排尿反射作用。我们采用了脊髓第10胸节(T10)水平完全横断的脊髓损伤雄性大鼠作为模型动物,损伤3周后,使用膀胱内压测定(cystometry,CMG)和尿道外括约肌(external urethral sphincter,EUS)肌电图来检测大鼠的排尿功能。在实验过程中,我们分别使用静脉注射给予了不同剂量的4种药物:多巴胺D1样受体激动剂SKF 38393;多巴胺D1样受体拮抗剂SCH 23390;多巴胺D2样受体激动剂quinpirole;多巴胺D2样受体拮抗剂remoxipride。结果显示,激动Di样受体对排尿反射并没有显著影响,而阻断D1样受体增加了膀胱收缩时的内压以及EUS在静息状态下的收缩活动。相反,阻断D2样受体并没有显示出明显的效应,激动D2样受体则表现出了对排尿反射的促进作用。为了排除静脉给药所可能造成的外周效应的影响,我们也测试了鞘内注射同样的4种药物,并且得到了与静脉给药非常相似的结果,表明药物对排尿反射的效应的确是来自于脊髓。以上实验结果说明,雄性大鼠的脊髓内源性多巴胺信号对脊髓损伤后的排尿反射具有调节作用,并且可以通过作用于不同的受体发挥不同的调控效应。脊髓水平的D1样受体更多参与膀胱的贮存功能,而D2样受体则主要参与膀胱的排空。这些结果为以后脊髓损伤后排尿功能调控机制的进一步研究提供了参考,脊髓内源性多巴胺信号也可作为一个新的治疗靶点,为未来脊髓损伤后排尿功能的恢复提供新的思路。第三部分激活特定脊髓多巴胺通路改善脊髓损伤雄性大鼠自发排尿功能正常的排尿功能受脑-脊髓-下泌尿道之间复杂的神经反射调控。在创伤性脊髓损伤中,由于失去了脊髓上位的神经支配,排尿反射会暂时消失,随意排尿功能也会缺失。尽管在损伤发生一定时间后,在脊髓水平会发生反射通路的重塑,可以恢复部分非随意性的自发排尿,但其功能仍十分受限。在CMG实验中我们观察到了激活脊髓内多巴胺D2样受体所产生的促排尿效应,因此在这一部分的实验中我们测试了其是否也能促进自发排尿功能。模型动物同样为脊髓T10节段完全横断的雄性大鼠,在损伤3周后,我们使用了代谢笼对大鼠的自发排尿量进行连续6小时的监测,药物通过皮下注射给药。结果显示,应用D2样受体激动剂quinpirole显著增加了自发排尿的总尿量和排尿频率,说明激活脊髓内D2样受体具有促进自发排尿的作用。我们同时还测试了多巴胺的前体物质左旋多巴以及多巴胺非选择性激动剂apomorphine,但这两者都未表现出明显的作用。这两种药物都可以同时激活D1样受体和D2样受体,但这两种受体所介导的效应可能因互相作用互相平衡而最终没有对自发排尿产生显著性的影响。这些结果证实了激活脊髓内多巴胺D2样受体可以促进脊髓损伤雄性大鼠的自发排尿功能,并为脊髓损伤后促进恢复自发排尿提供了新的实验依据和理论基础。